斑节对虾(Penaeus monodon)是世界三大养殖虾类之一,是我国固有养殖品种,其养殖产业在世界对虾养殖业中占有重要地位。近年来,随着高密度、集约化养殖模式的出现和发展,导致养殖环境恶化,病害频发。然而,由于斑节对虾体缺乏获得性免疫途径,其先天免疫便成了其抵御外界病原入侵主要防线。抗菌肽(Antimicrobial Peptide,AMP)是已被证实是先天免疫的重要效应分子,具有广谱抗菌作用。抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharride factor,ALF)是一类主要存在于甲壳类动物中的抗菌肽分子,被认为是极具前景的新一代抗菌药物,在对虾先天免疫中起重要作用。据此,针对ALF基因展开系列研究,阐明其抗病机制,不仅可以为我国对虾养殖过程中病害防治手段或产品开发提供科学数据,而且对实现我国绿色、健康水产业的科学发展规划意义重大。本研究以斑节对虾为研究对象,克隆了斑节对虾抗菌肽PmALF-like基因(PmALF-like)的c DNA序列,摸清了其在副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)刺激下的表达规律,验证了其体外抑菌活性,并对其在副溶血弧菌刺激下斑节对虾中的抗菌作用进行了探究。具体实验研究结果如下:(1)利用RACE技术获得了PmALF-like的c DNA序列,分析了其序列特征和进化地位,预测了其蛋白结构,结果发现,斑节对虾PmALF-like基因c DNA序列全长1242 bp,包括45 bp的5’非编码区(Untranslated Regions,UTR)、798 bp的3’UTR和399bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),共编码132个氨基酸;分子量为15.26KDa,理论等电点(p I)为7.67;通过在线软件Signal P-5.0预测斑节对虾PmALF-like蛋白信号肽发现在其第18个氨基酸处出现信号肽剪切位点。PmALF-like氨基酸序列与其他物种的ALF氨基酸序列存在一定相似性,其中与南美白对虾ALF-like氨基酸序列、日本对虾ALF-H1氨基酸序列、中国对虾ALF-like氨基酸序列的相似度较高。基于ALF氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树分析表明,PmALF-like氨基酸序列先与南美白对虾聚为一支,再与日本对虾和中国对虾聚为一大支。(2)通过实Carcinoma hepatocelular时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PmALF-like基因的组织表达及在副溶血弧菌刺激下的表达特征。结果显示,PmALF-like基因在斑节对虾的不同组织中均有表达,其中在肝胰腺中的表达丰度最高,其次依次为血淋巴、肠、心、鳃和肌肉。在注点击此处射副溶血弧菌后的6 h、12 h、24 h、48 h斑节对虾PmALF-like基因血淋巴组织的表达量显著高于与空白组;在注射副溶血弧菌后的6 h、12 h、24 h、48 h、72 h斑节对虾PmALF-like基因在肝胰腺组织的表达量显著selleckchem高于与空白组。原位杂交结果显示,注射副溶血弧菌后6 h、12 h的斑节对虾肝胰腺组织中的PmALF-like基因的阳性信号明显强于PBS组,从亚细胞层面进一步表明副溶血弧菌刺激可显著改变PmALF-like基因表达。通过注射实验表明,PmALF-like成熟肽能降低感染副溶血弧菌后斑节对虾的死亡数量。(3)获得PmALF-like成熟肽,并通过体外实验解析其抑菌功能。利用原核表达方法在体外成功获得不含信号肽的PmALF-like成熟肽,借助液体培养基法和牛津杯法等实验发现PmALF-like成熟肽对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、副溶血弧菌(V.Parahemolyticus)及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的生长具有明显的抑制作用。通注射PmALF-like成熟肽的方法过表达斑节对虾PmALF-like基因,发现副溶血弧菌刺激刺激后,斑节对虾死亡数量显著低于对照组,表明PmALF-like成熟肽能有效抵御病菌入侵,提高成活率。(4)为进一步研究PmALF-like抵御副溶血弧菌入侵的功能机制,我们对斑节对虾肝胰腺、血淋巴组织的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,ACP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)进行了免疫酶活性测定,实验结果表明:control组的SOD、ACP、AKP活性整体水平较低且相对稳定。PBS+V.P处理组、Trx+V.P处理组、PmALF-like+V.P处理组在0-6 h的SOD活性显著增强(p<0.05),6 h、24 h、48 h、72 h各时间点随着注射时间增加SOD活性出现下降趋势。PmALF-like+V.P处理组较PBS+V.P处理组、Trx+V.P处理组ACP、AKP能更快的达到最大值。上述实验结果说明副溶血弧菌感染对斑节对虾肝胰腺、血淋巴组织SOD、ACP、AKP活性有显著影响。注射PmALF-like成熟肽可以适当降低感染副溶血弧菌的斑节对虾死亡数量,可能增强了斑节对虾的先天免疫。