放射型根瘤菌(R.radiobacter)是土壤中典型的固氮微生物,目前对于根瘤菌的研究主要集中在其固氮共生作用上,其所分泌的表面寡糖与豆科植物成功共生密切相关。因此,研究根瘤菌寡糖的化学结构和理化性质有助于了解其构效关系,拓宽其潜在的应用领域。本文首先对R.radiobacter ATCC 13333的发酵工艺进行优化以提高胞外寡糖产量,然后在比较转录组水平上对不同氮源浓度影响下的胞外寡糖的合成机制进行初探,为开发R.radiobacter ATCC 13333胞外寡糖发酵提供了理论依据。其次通过发酵液的分离纯化,得到了COGs-1和COGs-3并对二者的结构性质进行了详细解析。最后基于COGs-1独特环状结构,将其作为理想的包埋载体与姜黄素包埋并探究包合物的体外益生活性,拓宽了R.radiobacter ATCC 13333胞外寡糖的应用前景。Torin 1半抑制浓度主要研究结果如下:(1)为提高胞外寡糖的发酵产量,采用单因素法和响应面法对R.radiobacter ATCC13333的培养基组成和EPZ-6438小鼠培养条件进行优化。得到最佳的摇瓶发酵条件为甘露醇20 g·L~(-1)、谷氨酸2.5 g·L~(-1)和初始p H为7.0。在此条件下,发酵144 h时胞外寡糖产量为2.68 g·L~(-1),比优化前提高了88.8%。针对氮源浓度过高会导致副产物黑色素浓度升高这一问题,在7 L发酵罐上构建两阶段p H耦合溶氧控制策略,生长期p H设置为7.0,胞外寡糖合成期p H调整为6.0并且溶氧控制在40%。在此策略下,发酵120 h时,胞外寡糖产量和生物量分别增加至4.18 g·L~(-1)和7.84 g·L~(-1),比无p H控制发酵分别提高了88.3%和115.4%,同时抑制了发酵液中黑色素浓度,使其显著降至0.11 g·L~(-1)。(2)为了探究不同谷氨酸浓度对R.radiobacter ATCC 13333产胞外寡糖和黑色素相关基因表达的影响,对其进行比较转录组测序分析。结果显示,与高浓度谷氨酸相比,低浓度谷氨酸条件下糖酵解途径中葡萄糖激酶、葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和糖基转移酶的基因表达量显著增高,而如三羧酸循环等能量相关的代谢途径的基因表达量显著下降。这表明低浓度谷氨酸有利于葡萄糖的转化,有助于提升寡糖产量,而在高浓度条件下生成了更多的ATP、中间代谢物以及辅助因子,强化了细胞生长和黑色素合成代谢。(3)结合乙醇分级沉淀、固相萃取法以及阴离子交换色谱等纯化方法对发酵培养基中的胞外寡糖进行分离纯化,得到2种主要成分:COGs-1和COGs-3。其次通过比色法发现COGs-1和COGs-3中总糖分别为96.2±0.05%和95.9±1.02%。利用傅立叶红外光谱、单糖组成分析、甲基化和核磁共振等技术方法对COGs-1和COGs-3进行结构解析,结果表明:COGs-1是以葡萄糖为单体,由β-1,2-糖苷键连接而成的环葡聚糖,聚合度分布为17～23,无侧链基团,是一种典型的环β-1,2-葡聚糖;COGs-3的分子量和分子式分别为1584 Da和C_(59)H_(92)O_(49),其结构为β-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→3)-β-Glcp-(1→6)-β-Glcp-(1→6)Physio-biochemical traits-β-Glcp-(1→4)-β-Glcp-(1→4)-β-Glcp-(1→3)-α-Gal,含有两个琥珀酸基和一个丙酮酸基修饰基团,是一种新型的琥珀酰聚糖。通过差示扫描热量分析和热重分析显示COGs-1和COGs-3具有良好的热稳定性。(4)基于对环β-1,2-葡聚糖的特殊大环状结构的表征,将其与姜黄素包埋并探究其益生活性。相溶解度分析结果表明:姜黄素-环β-1,2-葡聚糖包合物的稳定常数为930 M~(-1)。同时,通过傅立叶红外光谱、差示扫描热量仪、扫描电镜和核磁共振等手段对包合物进行了表征。结果显示:环β-1,2-葡聚糖可与姜黄素形成包合物。通过体外模拟消化实验得出:环β-1,2-葡聚糖呈现了较高的消化抗性,而姜黄素-环β-1,2-葡聚糖包合物中的姜黄素释放率达到88±1.8%。典型益生菌发酵实验结果表明:与空白组相比,环β-1,2-葡聚糖及姜黄素-环β-1,2-葡聚糖包合物组可以显著促进益生菌的生长和短链脂肪酸的生成。健康人粪便静态发酵实验结果显示,与空白组相比,环β-1,2-葡聚糖组的乙酸和乳酸浓度显著提高,双歧杆菌属和乳杆菌属等关键细菌种类丰度增加,克雷伯杆菌属等致病菌的相对丰度显著减少。与环β-1,2-葡聚糖和低聚果糖组相比,姜黄素-环β-1,2-葡聚糖包合物组显著提高乙酸、丙酸和乳酸的浓度,显著促进双歧杆菌属和乳酸菌属等有益菌增殖,而乳球菌属、链球菌属和克雷伯杆菌属等潜在致病菌的相对丰度显著减少。综上,环β-1,2-葡聚糖和姜黄素-环β-1,2-葡聚糖包合物均显著增加短链脂肪酸的产生,改变了肠道菌群的组成,促进了有益菌群的增殖,抑制了有害菌的生长,包合物具有双重的益生功效。