细胞应激反应对植物的生长发育至关重要。当植物面对外界刺激或内源压力时,细胞应激系统首先使细胞适应特定的刺激并修复损伤,一旦刺激性损伤无法被消除,将触发细胞死亡信号通路。核糖体是细胞内具有翻译功能的核糖核蛋白颗粒,其生物合成过程复杂而有序,涉及大量核糖体组装因子。核糖体的合成过程对植物的生长发育十分重要,该过程一旦出现异常,会触发核糖体应激反应。核糖体应激抑制m RNA的翻译,导致全局蛋白质合成下降,从而通过负反馈机制控制基因的表达。植物核糖体应激通常使植株表现典型的生长缺陷,例如:主根变短、叶片变尖变窄、育性降低等。尽管动物细胞中的核糖体应激信号通路已经得到深入研究,但植物细胞中的具体机制尚不清楚。AAA-ATPase Midasin1(MDN1)是拟南芥中重要的pre-60S核糖体生物发生因子,在60S核糖体亚基的成熟过程中发挥作用并参与其核输出。mdn1-1是MDN1功能降低突变体,该突变体的MDN1基因发生错义突变,表现典型的核糖体应激表型。RNA-seq分析结果显示,mdn1-1突变体中NAC转录因子NAC044、NAC085以及NAC103相关基因表达上调,本研究以此为背景,探究了转录因子NAC044、NAC085以及NAC103在MDN1突变引发的核糖体应激中的作用。主要研究结果如下:1、本研究通过分析转录组数据,鉴定到mdn1-1突变体中NAC转录因子NAC044、NAC085以及NAC103相关基因的表达显著上调。为了直观地了解相关基因在mdn1-1突变体中的表达情况,本研究将ProNAC044:GUS报告株系与mdn1-1杂交,通过GUS染色法观察野生型及mdn1-1背景下NAC044启动子信号的分布,发现NAC044在mdn1-1突变体根尖、茎尖以及RAM等细胞分裂旺盛区域强烈表达。2、在mdn1-1背景下分别敲除NAC044、NAC085或NAC103的功能,突变体的根部缺陷以及植株半不育表型得到明显缓解,其中nac085-1/mdn1-1突变体的表型变化最明显,表明NAC044、NAC085和NAC103均在mdn1-Inorganic medicine1突变体的根发育缺陷以及育性降低中发挥作用,并且NAC085的作用效果最显著。3、为了探究NAC044、NAC085以及NAC103在mdn1-1突变体中是否存在功能冗余现象,本研究对杂交得到的三重突变体044-1/085-1/mdn1-1和044-1/103-11/mdn1-1进行表型分析,结果发现同时敲除两个转录因子后,突变体的表型与双突相比没有显著差异,这表明NAC044、NAC085、NAC103在mdn1-1突变体中各自发挥作用。另外,本研究在获得突变体的过程中发现,同时突变NAC103和NAC085会导致雄性不育。据此初步推测,NAC085可能与NAC103结合形成异源二聚体从而激活下游相关基因的表达。4、在植物DNA损伤反应中,NAC044、NAC085和NAC103均受SOG1的调控。为了探究mdn1-1突变体对核糖体应激的响应是否依赖DNA损伤信号通路,对突变体sog1-1/mdn1-1和atm-2/mdn1-1的表型进行观察,结果表明,sog1-1/mdn1-1和atm-2/mdn1-1的主根表型以及根尖结构与mdn1-1突变体相比没有显著差异。另外RNA-seq分析发现,在mdn1-1背景中,NAC044、NAC085和NAC103的表达不受SOG1的介导。以上结果说明MDN1突变引发的核糖体应激响应不依赖SOG1介导的DNA损伤信号通路。5、NAC044、NAC085和NAC103在mdn1-1突变体中发挥作用导致根尖分生区细胞数目减少,为了探究这一现象的具体机制,本研究通过EdU染色观察不同突变体根尖分生区进入S期的细胞密度。结果发现与野生型相比,mdn1-1以及sog1-1/mdn1-1突变体根尖分生区进入S期的细胞密度减小;而在nac085-1/mdn1-1突变体中,多数根尖分生区细胞进入S期,这表明mdn1-1突变体根尖分生区细胞数目减少是由于细胞周期进程受到影响,NAC085在mdn1-1根尖细胞的G1/S阻滞中发挥重要作用。将SMR5:NLS-GFP导入野生型及mdn1-1突变体,观察不同株系根尖细胞中SMR5启动子活性,结果发现由于核糖体合成缺陷,mdn1-1突变体根尖处SMR5的启动子活性显著提高,而RNA-seq分析表明,在nac044-1/mdn1-1、nac085-1/mdn1-1、nac103-11/mdn1-1和sog1-1/mdn1-1突变体中,NAC044、NAC085、NAC103以及SOG1功能的丧失均显著降低SMR5的表达。上述结果表明,NAC044、NAC085、NAC103以及SOG1参与mdBelumosudiln1-1突变体根尖细胞的细胞周期调控。另外,不同突变体叶片细胞的流式分析结果显示,NAC044、NAC085以及NAC103在mdn1-1突变体叶片细胞的G1/S检查点的停滞中也发挥一定作用。6、为了确定NAC103、NAC044和NAC085在核糖体应激响应中的作用是否具有广适性,本研究使用核糖体发生抑制剂处理各突变体材料,分析处理后突变体的表型发现,nac085-1突变体对核糖体发生抑制剂有较强的抗性。另外,在核糖体缺陷材料lsg1-2背景下突变NAC085后,突变体的根部表型缺陷得到缓解。以上结果表明NAC085是通用的核糖体应激信号介导因子。7、为进一步确定影响mdn1-1表型的原因,取材7 DAG(Days after germinationNSC125066采购)野生型、mdn1-1、nac044-1/mdn1-1、nac085-1/mdn1-1、nac103-11/mdn1-1和sog1-1/mdn1-1突变体幼苗根部进行RNA-seq测序。分析结果发现,种子中特异表达的ABI3、ABI5以及种子贮藏蛋白相关基因在mdn1-1根尖部位异位表达,这一结果为接下来的研究提供了新的方向。8、TOR激酶是真核生物生长发育的核心调控因子,能够协调核糖体的发生。为了观察敲低TOR功能是否对mdn1-1表型产生影响,本研究使用TOR诱导沉默株系tor-es与mdn1-1突变体杂交,在雌二醇的诱导下,mdn1-1/tor-es显著恢复了mdn1-1突变体的根部表型缺陷,表明TOR激酶可能通过一条不同于NAC转录因子的通路参与MDN1突变引发的核糖体应激响应。综上,本研究认为转录因子NAC085、NAC044和NAC103均参与MDN1突变引发的核糖体应激响应,其中NAC085的作用最为显著,当核糖体应激发生时,NAC085能够通过靶向下游细胞周期相关基因使细胞周期停滞,从而保证细胞能够适应缺陷并修复损伤。此外,蛋白激酶TOR也参与了核糖体应激响应,具体机制还有待进一步探究。