目的肉毒杆菌神经毒素由于其具有超毒、速效、难防等特点,是一种潜在的生物战剂,对国防安全及人民健康存在巨大威胁。而针对肉毒神经毒素的主要抗毒策略研究和关键技术方案一直由美国等西方国家主导控制,属于“卡脖子”关键技术。国内和军内对于该类毒素的研究一直未取得理想进展,抗毒策略尚不成熟。现有研究显示抗毒素中和单克隆抗体能够在体外有效中和不同血清型肉毒神经毒素,但将其应用于体内抗毒还存在以下问题:(1)单克隆抗体药物在生物体内循环半衰期较短,难以发挥长期保护作selleck VX-661用;(2)单克隆抗体药物难以进入胞内发挥作用;(3)肉毒毒素侵袭速度极快,现有单抗药物的应用方式无法满足极为苛刻的即时性要求。这些问题导致抗毒素单克隆抗体的体内抗毒效力始终未得到广泛的认可,应该采用什么样的防护策略有待于进一步探究。这也是肉毒神经毒素单抗防治研究领域的关键科学问题所在。因此,本研究针对这一科学问题,创新提出“预先施用”、“胞内合成”、“长期表达”的新型被动免疫预防抗毒策略,发展建立了以腺相关病毒为载体,以单链抗体为抗毒效应因子的工程技术方案,并测试评估了这一新型被动免疫预防Iodinated contrast media抗毒策略在A型肉毒杆菌神经毒素体内防治中的价值。方法A型肉毒杆菌神经毒素重链羧基端结合功能域(Clostridium botulinum neurotoxin heavy chain/BONT/AHc)基因重组表达与纯化经GENEBANK及Uniprot数据库查询确定BONT/A羧基末端受体结合结构域的氨基酸和DNA原始序列作为天然模板,通过降低稀有密码子含量及偏好密码子替换对其序列进行优化并克隆于p GEX-6P-1载体。质粒转染工程大肠杆菌BL21(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导BONT/AHc抗原蛋白的表达,通过GST亲和层析和AKTA pure纯化系统提取、富集及纯化目的蛋白,经蛋白质谱及SDS-PAGE验证其序列及纯度。BONT/AHc单克隆抗体筛选鉴定及单链抗体(Single-Chain Fragment VDocetaxel体内实验剂量ariable,sc Fv)重组制备以纯化BONT/AHc蛋白作为抗原,对BALB/C小鼠进行三轮抗原佐剂混合免疫及冲击免疫,并利用ELISA检测鼠尾血清抗体滴度。对免疫鼠进行预攻毒实验,选取最佳保护性免疫鼠,在无菌条件下提取和制备其脾淋巴细胞与预制备小鼠SP2/0骨髓瘤细胞混合,采用PEG法制备杂交瘤细胞。ELISA检测细胞培养上清液的抗体滴度,通过有限稀释法对杂交瘤细胞系进行亚克隆化,挑取分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。通过杂交瘤测序获取单克隆抗体可变区的氨基酸序列,以简单linker(GGGGGSGGGGSGGGGS)连接构建sc Fv,并将其克隆于p GEX-6P-1及p ET-22b(+)表达载体中,探索sc Fv在大肠杆菌中的最佳原核表达模式。重组蛋白经镍柱亲和层析和AKTA pure纯化系统提取、富集及纯化后通过蛋白质谱及SDS-PAGE等技术验证其序列及纯度。单链抗体性质表征及载体免疫预防(vectored immunoprophylaxis,VIP)策略研究利用western blot验证单链抗体与BONT/AHc抗原之间的结合。进一步采用BIAcore中的SPR技术检测sc Fv与BONT/AHc的亲和力。将sc Fv基因克隆于AAV载体,建立病毒介导的VIP抗毒策略。将纯化的病毒稀释至预定的体积剂量,注射于小鼠腓肠肌区域。ELISA测定血清抗体浓度,于抗体峰值期将规定剂量的BONT/A毒素经腹腔注射到小鼠体内建立小鼠攻毒模型,连续14日观察小鼠生存情况,记录各组的每日死亡数并绘制存活曲线,评估胞内抗体在体内的中和活性及保护作用。使用Alpha Fold2程序对82-sc Fv序列和经linker连接合成的BONT/AHc-82-sc Fv复合物序列进行从头建模,选择打分最好的模型并经SAVES 6和拉氏图验证蛋白结构的合理性。进行蛋白质-蛋白质分子对接,上传至PDBe PISA分析蛋白质复合体中的相互作用面,分析抗原-抗体复合物相互作用机制,并利用pymol软件进行可视化处理。结果成功构建BONT/AHc-p GEX-6P-1原核表达质粒,利用大肠杆菌原核表达系统、GST亲和层析和AKTA PURE纯化系统等技术以及Pre Scission蛋白酶,获得高纯度BONT/AHc重组蛋白并去除内毒素和标签。经SDS-PAGE鉴定,重组BONT/AHc抗原蛋白大小约为45k Da,纯度高于95%,符合免疫动物的要求。利用BONT/AHc蛋白免疫6只BALB/C小鼠,鼠尾血清ELISA结果显示,除免疫动物84号和86号,其余4只免疫小鼠的血清抗体滴度均高于1:200000,并且小鼠82号具有最高的抗体效价水平。经预攻毒实验,确认以82号小鼠脾淋巴细胞和小鼠SP2/0骨髓瘤细胞建立杂交瘤细胞系并亚克隆化,最终鉴定出100%阳性率的单克隆杂交瘤细胞株,命名为82-G10,其所分泌单抗与BONT/AHc之间具有较强的结合活性。对82-G10杂交瘤细胞单抗进行测序,提取VH和VL序列并通过简单linker(GGGGGGGGSGGGGGGGS)连接构建完整82-sc Fv基因序列。利用p GEX-6P-1和p ET-22b(+)载体分别构建82-sc Fv原核表达质粒,探索确认p ET-22b(+)载体可行性并于大肠杆菌原核表达平台实现了82-sc Fv的可溶性表达,经镍柱亲和层析及AKTA PURE等技术的富集及纯化,SDS-PAGE结果显示82-sc Fv重组蛋白大小约为25k Da,且纯度在95%以上。经蛋白免疫印迹鉴定,确认了82-sc Fv与BONT/AHc的结合,并进一步通过Biacore中的表面等离子体共振(SPR)技术对82-sc Fv单链抗体与BONT/AHc抗原的结合动力学评估,KD值为1.148E-09。基于82-sc Fv建立AAV载体介导的免疫预防抗毒策略,于肌注病毒后10日左右血清抗体浓度到达峰值,约为70μg/ml。小鼠攻毒实验显示,82-sc Fv治疗组相较于对照组表现出近一倍的生存率改善趋势。利用Alpha Fold2对抗原-抗体复合物三维结构预测建模,分析了其相互作用机制并进行了可视化展示。结论本工作针对肉毒神经毒素单抗防治研究领域的关键科学问题,创新提出一种针对肉毒毒素的新型被动免疫预防抗毒策略,发展建立了以腺相关病毒为载体,以单链抗体为抗毒效应因子的工程技术方案,达到了这一新型被动免疫预防抗毒策略在A型肉毒杆菌神经毒素体内防治“预先施用”、“胞内合成”、“长期表达”的预期目的,形成了针对A型肉毒毒素的抗毒储备能力,助力解决国防安全中的“卡脖子”问题,具体体现在:1、利用原核制备的纯化BONT/AHc蛋白作为抗原对BALB/C小鼠进行免疫,创新性地采用小鼠预先攻毒实验模式,探索优化抗毒素中和单克隆抗体筛选方案,这一方案改变了以往常规的研究范式,即将“先抗体筛选——后中和研究”改变为“预中和确定效果——抗体筛选——再次中和验证”的开发策略。因此,通过杂交瘤实验淘选出分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株82-G10,其所分泌单克隆抗体不仅对BONT/AHc具有较好的结合活性,其中和效力也得到预验证。2、探索了sc Fv单链抗体的原核表达及制备路线,实现82-sc Fv单链抗体的可溶性高纯度表达。82-sc Fv能够与BONT/AHc特异性结合并具有优秀的亲和活性。同时,经Alpha Fold2对抗原-抗体复合物三维结构预测建模,为其相互作用分析提供结构生物学支持。3、创造性探索建立了新型毒素保护VIP策略,即AAV介导的中和胞内抗体呈递方案,拓展了VIP策略的应用范围。基于82-sc Fv成功构建了AAV介导的抗体基因工程药物,在腹腔注射A型肉毒神经毒素建立的小鼠攻毒模型中,AAV介导的VIP策略在预防模式下有效降低了暴露于A型肉毒毒素小鼠的死亡率,证明了其在应对毒素攻击的保护性作用及免疫预防价值。