胃癌是消化系统癌症中最常见的癌症之一,发病率和死亡率都很高,在所有癌症中排名前五。相比之下,男性患病的概率大约是女性的两倍。大多数患者在确诊时已处于晚期,因此患者的死亡率非常高。本课题组前期研究表明,microRNA-144(miR-144)在胃癌细胞内的表达量异常降低,具有类似肿瘤抑制子的作用,具有潜在的临床应用价值。但游离的miRNAs可被血清中的核酸酶消化,即使到达靶组织,也容易被溶酶体降解。因此,本研究构建了PAMAM/miR-144纳米复合物,保护miR-144免受核酸酶降解,将miR-144递送至肿瘤微环境,增加胃癌组织内miR-144的含量,抑制胃癌的生长。胃癌在中医学中属于“噎膈”、“反胃”、“症瘕”、“积聚”、“伏梁”、“心腹痞”、“胃脘痛”的范畴。其发病主要因情志不遂、正气不足、饮食不节、脾胃虚衰而损伤脾胃,致使痰凝气滞、热毒血瘀阻络于胃,积聚发病。胃癌病变在胃,而胃的主要功能为受纳、腐熟,故当胃部发生癌变后,影响其受纳、腐熟的功能,致使脾胃失和、运化失健,而脾胃为后天之本,随着病情发展、恶化,脾损及肾,致使脾肾阳衰。《脾胃论》中有“人以胃气为本”“内伤脾胃,百病由生”之说,足以说明脾胃之于人体的重要性。扁蒴藤素是一种天然醌类三萜单体化合物,可从卫矛属植物中萃取。该类植物味苦、辛,性微温,归肝、脾、大肠经,具有祛风除湿、活血行气、解毒消肿的功效。研究发现,扁蒴藤素能够显著阻止肿瘤细胞的生长与增殖,并诱导其凋亡。本论文主要研究扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144抑制人胃癌AGS细胞迁移和侵袭的作用及分子机制。研究内容主要分为四个部分。第一部分:miR-144的表达量与胃癌的相关性分析目的:探究miR-144的表达水平与不同类型的消化道恶性肿瘤发生的关系。方法:利用生物信息学技术,从数据库中挖掘食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结直肠癌6种消化道恶性肿瘤的数据,采用单因素方差分析,对比肿瘤组织样本与正常组织中miR-144的表达水平差异。结果:miR-144的表达量,在人胰腺癌、肝癌、胆管癌及胃癌组织中显著低于正常组织,在结直肠癌中的表达高于正常组织(P<0.05)。结论:miR-144在胃恶性肿瘤中的表达显著降低。第二部分:扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144对人胃癌AGS细胞的影响目的:研究扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144抑制人胃癌AGS细胞侵袭转移的作用及分子机制。方法:构建PAMAM/miR-144纳米颗粒。人胃癌AGS细胞,用PAMAM/miR-144预处理24 h后,加入不同浓度的扁蒴藤素(0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 μM),处理24 h后,MTT法检测不同浓度的扁蒴藤素协同PAMAM/miR-144对人胃癌AGS细胞增殖能力的影响。Transwell实验和划痕实验,检测人胃癌AGS细胞侵袭和迁移能力的变化。qRT-PCR检测细胞内mTOR mRNA的表达水平。Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达量。结果:成功构建PAMAM/miR-144纳米颗粒,理化性质稳定并具有降低mTOR mRNA的生物学活性。与单用PAMAM/miR-144处理组相比,扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144给药后,明显抑制人胃癌AGS细胞的增殖(P<0.05);抑制人胃癌AGS细胞的划痕愈合程度(P<0.05);显著抑制人胃癌AGS细胞的迁移和侵袭;明显降低人胃癌AGS细胞内mTOR mRNA的表达(P<0.05)。人胃癌AGS细胞中的mTOR、PI3K、AKT、4EBP1等蛋白的表达量均有不同程度降低(P<0.05)。结论:扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144,明显抑制人胃癌AGS细胞的侵袭和迁移,其分子机制,可能与PI3K/AKT/mTOR信号转导通路相关。第三部分:PAMAM/miR-144纳米颗粒的安全性检测目的:探究PAMARedox biologyM/miR-144纳米颗粒,是否具有用于体内治疗的生物安全性。方法:分别制备PAMAM溶液(2.5μg/μL)、miR-144-CY5溶液(10 pmol/mL)及PAMAM/miR-1LY294002纯度44-CY5 溶液(PAMAM:miR-144 容积比=1:2),以正常治疗剂量的 3-5倍,通过尾静脉注射入小鼠体内,观察小鼠的精神状况,记录体重、饮食等一般情况。分别于注射后1h、16h、96h,通过小动物活体成像检测小鼠尾静脉的荧光强度。于第7 d和第14 d,每组处死一半小鼠,取血清进行肝肾功能等生化检测。剥离心肝脾肺肾及胃等脏器,清洗吸干水分后,称重并记录,行病理切片,显微镜下观察小鼠的脏器有无病理性改变。结果:14d内,小鼠的体重无明显变化,表明PAMAM/miR-144对小鼠生长没有显著的影响。各组小鼠ALP水平及AST/ALT比值均保持正常,表明肝功能正常。与正常对照组比较,各组小鼠血尿素氮(BUN)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、磷(P)水平均无明显变化,表明所有小鼠肾功能正常。各小鼠心、肝、脾、肺、肾和胃的组织病理学图像中,未观察到异常变化。对比脏器指数(即器官重量与体重之比,mg/g),无明显差异。小动物活体成像结果显示,对照组和PAMAM组的小鼠尾静脉中无荧光显示。miR-144-CY5组,8只小鼠中,仅1只在尾静脉注射后1h、16 h可见荧光,96 h荧光消失。PAMAM/miR-144-CY5复合物组中,在1h、16h和96h,每只小鼠尾静脉均可见荧光。结论:PAMAM/miR-144具有良好的生物相容性,对miR-144具有较强的保护作用,可防止其被血液中的核酸酶降解,且生物安全性比较好,可用于体内治疗。第四部分:扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144抑制胃癌生长的体内研究目的:研究PAMAM/miR-144-CY5在人胃癌荷瘤裸鼠体内的分布,以及扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144对小鼠胃癌移植瘤的治疗作用。方法:首先研究PAMAM/miR-144-CY5在荷瘤小鼠体内的分布。BALB/c裸鼠12只,分为4组,每组3只。对数期人胃癌BGC-823细胞,皮下注射,构建人胃癌皮下移植瘤模型。10 d后,肉眼明显可见移植瘤后,尾静脉分别注射生理盐水、PAMAM(2.5μg/μL)、miR-144-CY5 溶液(10 pmol/mL)及 PAMAM/miR-144-CY5 溶液(PAMAM:miR-144容积比=1:2)各20 μL,分别于注射后6h、24h、48 h,利用小动物活体成像系统,观察PAMAM/miR-144-CY5的靶向运输作用。拍摄结束后,处死各组小鼠,取出心肝脾肺肾胃及移植瘤行活体成像,观察PAMAM/miR-144-CY5在不同脏器及组织内的留存情况。取24只BALB/c裸鼠,随机分为4组,每组6只。分别为阴性对照组、PAMAM/miR-144 组、扁蒴藤素联合 PAMAM/miR-144 组及 DDP 组。阴性对照组,尾静脉注射生理盐水20μL;PAMAM/miR-144组,尾静脉注射20 μL;扁蒴藤素(0.8 mg/kg),腹腔注射;DDP(2 μg/mL),腹腔注射200μL。各组给药后,观察裸鼠精神、饮食等一般状况,每3d用游标卡尺测量一次肿瘤的长短径,并计算肿瘤体积。每7d,行一次活体成像,实时观察记录肿瘤生长情况。第21 d,结束治疗,处死裸鼠,剥离肿瘤,比较各组移植瘤体积和重量,行石蜡切片,HE染色,显微镜下观察肿瘤细胞。结果:PAMAM/miR-144-CY5在荷瘤小鼠体内的分布情况,4组小鼠,剥离的心肝脾肺肾为及瘤体行活体成像,发现红色荧光仅在PAMAM/miR-144组的移植瘤内,表明PAMAM/miR-144能定向运输至肿瘤组织内,发挥治疗作用。6 h时,miR-144-CY5组及PAMAM/miR-144-CY5组在移植瘤处均可见红色荧光。24 h和48 h时,只有PAMAM/miR-144-CY5组可见红色荧光,说明PAMAM可保护miR-144在肿瘤内免受核酸酶降解。扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144对小鼠胃癌移植瘤的治疗作用的研selleck化学究,显微镜下观察移植瘤组织,发现各组肿瘤细胞排列紊乱,大小不一,细胞核深染,出现病理性核分裂,表明裸鼠的胃癌移植瘤模型构建成功。与对照组相比较,单独用PAMAM/miR-1 44 治疗后,移植瘤缩小,重量减轻;与单用 PAMAM/miR-144 治疗组相比,扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144组的抑癌效果更明显(P<0.05)。结论:PAMAM/miR-144能定向运输至肿瘤组织内,发挥治疗作用。扁蒴藤素联合PAMAM/miR-144,能显著抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长。