选题依据:抑郁症是一种常见的心理精神障碍疾CL 318952细胞培养病,其特征在于持续的情绪低落和思维迟缓。世界卫生组织(WHO)推测2030年抑郁症将成为全球第一大疾病~([1])。2019年的中国精神卫生调查发现中国有9500万人有不同程度的抑郁症。然而,目前上市抗抑郁西药虽然比较多,但西医对抑郁症病因、发病机制尚未明确,且大多数抗抑郁西药起效慢、成分单一、疗效低、副作用强~([2])。因此,依据抑郁症的临床表现和病理基础,在中医理论指导下,提出抑郁症中医临床治疗方法并在实践中修整完善,可以为临床抑郁症的诊治提供切实可行的路径,还有望采用中医“以方测证”思想,加强对抑郁症病机认识,为研发理想的抗抑郁药物提供科学依据。中医理论认为“心藏脉,脉舍神”,故养“神”亦在于养气血。临床研究表明,抑郁症患者常伴有心血不足、气血不畅、心脉淤阻等血虚病症~([3]),且在抑郁症的中医临床治疗上也有活血开郁法、养血解郁法的应用~([4])。流行病学研究发现,抑郁症患者伴发贫血的风险较高,贫血患者也更容易患抑郁症。因此,抑郁症与血虚证密切相关,剖析抑郁症与血虚证的相关性对抑郁症的治疗具有重大意义。当归的传统药效是“补血活血”,常有“十方九归”之美称。其在经典抗抑郁复方中使用频率高且占有重要地位,通常被认为起到的作用是补血活血。本课题组前期对单味药当归的抗抑郁作用进行了初步研究,发现当归不仅能逆转CUMS大鼠的血虚症状,还能有效缓解CUMS大鼠的抑郁样症状。然而当归对抑郁模型大鼠血虚症状的调节作用仍缺乏系统的研究,且其养血与解郁功效的相关性机制尚不明确。因此,本研究结合药理学、代谢组学、网络药理学和分子生物学多技术明确当归养血与解郁功效的相关性,阐明其相关性机制。目的:(1)明确当归养血与解郁功效间的相关性及其作用机制。(2)明确郁症与血虚证的关系,拓展抑郁症的治疗策略。方法:(1)运用LC-MS技术指认当归提取物中的化学成分,再通过网络药理学方法,预测当归化学成分的靶点、抑郁症与血虚证的共病靶点,富集与当归养血解郁密切相关的信号通路,构建成分-KPT-330核磁疾病-靶点-通路网络,揭示抑郁症与血虚证的共病机制,以及当归养血解郁的作用机制,从网络药理学角度阐明当归“养血”与“解郁”功效的相关性及机制,进一步运用分子对接技术对聚焦通路的潜在靶点进行验证。(2)采用CUMS抑郁模型,以当归为研究对象,抗抑郁西药文拉法辛为阳性对照,以体重、行为学指标及HPA轴功能指标为抑郁相关指标,血虚指标方面,在前期血流变、血常规、血气的基础上,拓展了造血功能、免疫功能及铁代谢功能为血虚相关指标,明确当归治疗CUMS模型大鼠的药效特点。结合主成分分析与相关性分析方法研究血虚指标与抑郁指标的相关性,明确当归抗抑郁作用与养血功效之间的相关性。(3)采用LC/MS脂质组学技术研究当归对CUMS大鼠机体中异常变化的脂类代谢物的调节作用,筛选与抑郁症相关指标及血虚相关指标均密切相关的差异代谢物和代谢通路,并将潜在效应指标与关键代谢通路的差异代谢物进行关联分析,聚焦关键鞘脂代谢物,从脂质代谢角度阐释当归“解郁”与“养血”功效的相关性机制。(4)基于脂质组学和网络药理学的研究结果,采用Western blot技术检测大鼠海马与肝脏中鞘脂代谢途径关键酶的表达量及蛋白磷酸化水平,包括中性鞘磷脂酶(n SMase)、神经酰胺合酶(Cer S)、鞘氨醇激酶-1(Sphk1)、丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)、PIK3CA、PIK3CD。明确当归发挥抗抑郁与养血作用的机制与鞘脂代谢途径密切相关。结果:(1)通过网络药理学构建抑郁症和血虚证的靶点通路网络,共富集107条通路。将超高效液相色谱-三重飞行时间质谱仪(UPLC-Triple-TOF/MS)提取的66个活性成分用于网络药理学分析,找到46个靶点与当归的养血解郁相关。通路富集分析进一步表明,鞘脂信号通路、甘油磷脂代谢通路等为当归的养血解郁关键通路。分子对接分析表明,当归有效成分E-藁本内酯与鞘脂信号通路关键蛋白(PIK3CA、PIK3CD)具有较强的结合活性。(2)药效学研究结果显示,当归给药组可以显著改善CUMS大鼠异常变化的糖水偏爱率、旷场实验穿越格数和直立次数、体重、强迫游泳不动时间、以及HPA轴激素水平(CRH、ACTH、CORT),表明当归具有确切的抗抑郁作用。此外,当归还可以逆转CUMS大鼠异常变化的免疫功能相关指标(IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、T淋巴细胞亚群CD4~+/CD8~+)、铁代谢功能指标(Hepcidin、TRF),表明当归具有改善CUMS诱导的大鼠血虚症状的作用。相关性研究结果显示,代表大鼠抑郁样症状的情志指数与代表大鼠血虚样症状的免疫功能和铁代谢功能显著相关。(3)脂质组学研究结果显示,主成分分析(PCA)中,空白组和模型组样本能沿t2轴明显分开,表明模型复制成功。PLS-DA模型排列实验表明模型可靠,无过拟合。对各组别进行了有监督的OPLS-DA分析,发现QC聚合,仪器稳定,当归和阳性给药对CUMS引起的大鼠血清脂质代谢紊乱有回调作用。进而根据S-plot图中VIP>1及统计学t检验(P<0.05)条件筛选空白组与CUMS组显著的差异脂质代谢物,结果显示,在筛选得到的50个异常变化的差异代谢物中,当归可显著回调Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)、SM(d18:0/24:1)等48个脂质代谢物。运用Metaboanalyst数据库进行通路富集分析,筛选到2条关键通路,分别为甘油磷脂代谢和鞘脂代谢,将鞘脂代谢通路的代谢物进一步统计分析,与潜在效应指标进行关联分析,发现神经酰胺类和鞘磷脂类代谢物与各潜在效应指标显著相关。(4)分子生物学结果显示,与空白组相比,CUMS组大鼠海马和肝脏中PIK3CA和PIK3CD的表达都明显降低,提示CUMS造模后鞘脂代谢紊乱。而经当归给药干预后,大鼠海马和肝脏中两种蛋白的表达量显著回调。该结果与网络药理学中的分子对接结果相同。此外,与对照组相比,CUMS组大鼠海马和肝脏中丝氨酸棕榈酰转移酶(SPTLC2)的表达均显著升高,而经当归给药干预后,SPTLC2的表达量显著回调(P<0.05)。CUmed-diet scoreMS造模后,大鼠肝脏中神经酰胺合成酶(Cer S2)、中性鞘磷脂酶(n SMase)和鞘氨醇激酶(SPHK1)的表达量显著降低,当归干预组(低、中、高剂量)的Cer S2、n SMase、SPHK1表达量显著回调,大鼠海马中n SMase和SPHK1的表达量显著降低,当归干预后n SMase、SPHK1表达量显著回调。结论:当归的抗抑郁作用和养血功效存在显著相关性。其机制可能是当归通过调节Cer/SM系统调控鞘脂代谢通路发挥养血解郁的功效。