研究背景斑块型银屑病,即寻常型银屑病,发病机制复杂,目前治疗方式虽种类繁多,但是缺乏长期有效的方法。根据课题组前期研究成果发现:①初期横断面调查显示斑块型银屑病患者存在脂肪代谢异常;②银屑病患者血清代谢组学结果提示血清中存在鞘脂代谢失衡现象,其中神经酰胺(Ceramide,Cer)、鞘磷脂(sphingomyelin,SM)表达异常;③蛋白组学结果提示银屑病小鼠皮损中,与Cer、1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)生成密切相关的蛋白酶SPTLC2、SPHK表达异常。结合文献调查提示,鞘脂代谢以Cer与S1P两种生物活性鞘脂为核心,两者可以相互转化,参与皮肤细胞多种代谢活动。Cer可以抑制角质形成细胞程序性凋亡,使之不能正常分化,从而过度增生;其次Cer是皮肤屏障重要的组成部分,具有良好的锁水能力。而S1P可参与NF-κB信号通路转导,影响淋巴细胞的迁移和分布。因此,斑块型银屑病与鞘脂代谢的失衡有着密切的联系。开玄解毒除湿方是中国中医科学院广安门医院皮肤科长期使用的临床经验方,由导师宋坪主任在传承名老中医经验的基础上,结合大量临床实践提出的临床经验方。该方由桂枝、麻黄、白花蛇舌草、龙胆草、青蒿、青黛、黄连、虎杖八味药组合而成,具有“开玄解毒、清热除湿”的功效,是银屑病临床上的有效治法。前期研究提示“开玄类”方对银屑病脂质代谢有一定的调节作用。因此,本研究提出假设,开玄解毒除湿方通过调节鞘脂代谢,从改善皮肤屏障功能、抑制表皮细胞增生和炎症信号通路、影响免疫细胞分布四个方面,最终起到改善斑块状银屑病皮损的作用。研究目的本研究首先利用银屑病小鼠模型为研究对象,明确开玄解毒除湿方对于斑块状银屑病的药效作用;其次利用靶向脂质组学的检测方法明确斑块状银屑病中鞘脂代谢异常现象,探讨开玄解毒除湿方对于具体鞘脂代谢产物的调节作用;结合网络药理学与分子对接的生物信息学分析手段预测开玄解毒除湿方参与调控鞘脂代谢相关蛋白靶点;最后利用银屑病小鼠模型、银屑病HaCat细胞模型为研究对象,鞘脂代谢产物S1P信号通路的功能拮抗剂作为对照,探讨开玄解毒除湿方及其活性成分调节斑块状银屑病鞘脂代谢的作用机制。研究方法:1.开玄解毒除湿方对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损的影响及安全性评价:60只SPF级别雄性C57小鼠,随机均分为5组,分别为空白组、模型组、开玄解毒中剂量组、开玄解毒高剂量组以及FTY720组。除空白组外,其余组均采用外涂62.5mg咪喹莫特的方法建立银屑病小鼠模型,干预5天,在第6天进行脾脏、皮肤、胸腺、血清取材。记录小鼠每日体重、每日皮损图像采集,进行PASI评分;行胸腺和脾脏指数测量;拍摄真皮毛细血管增生情况。综合以上结果评估开玄解毒除湿方对于银屑病小鼠皮损症状、体征的改善情况及安全性,同时筛选疗效良好的中药浓度。随后采用HE染色测量表皮厚度、免疫组化法检测皮损中PCNA含量评估表皮增生情况;WB法检测皮损中Claudin-1、Occludin蛋白含量评估皮肤屏障功能;WB法检测NF-κB信号通路蛋白含量评估炎症信号通路;WB法检测皮损及脾脏脏中CD3表达评估淋巴细胞迁移及分布情况;Elisa法检测IL-23、IL-17含量评估疾病炎症程度;同时行肝、肾组织HE染色,Elisa法检测血清中肝肾生化指标ALT、AST、BUN含量评估开玄解毒除湿方的药物安全性。2.靶向脂质组学检测开玄解毒除湿方对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损中鞘脂代谢产物含量收集实验一中健康组、银屑病模型组、开玄解毒除湿方高剂量干预组小鼠的皮损组织各10例,采取液谱质谱联用的方式,靶向检测分析皮损中的鞘脂代谢产物含量,包括 Cer、S1P、Sph、SM、GluCer、LacCer、GalCer。3.基于网络药理学与分子对接预测开玄解毒除湿方治疗斑块型银屑病的潜在靶点首先利用TCMSP和TCMIP中药在线数据库,筛选中药活性成分获取作用靶点;然后利用5个疾病数据库(GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET、DrugBank)建立斑块型银屑病作用靶点,获得药物与疾病的交叉靶点。利用获得的交集靶点,建立蛋白互作图、进行基因功能分析与通路富集分析。同时构建“药物成分-靶点-通络”网络图,根据拓扑参数选择排名前三的核心活性成分。最后利用分子对接技术进行核心成分与靶标蛋白的对接。4.开玄解毒除湿方参与咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损中鞘脂代谢的调节选择实验一中健康组、模型组、开玄解毒除湿方高剂量组、FTY720组的皮损组织。免疫组化法检测皮损组织中S1P的含量;免疫荧光法检测皮损中Cer的含量;WB法检测与Cer、S1P生成相关的蛋白酶SPHK、SPTLC2、ASAH1的含量;q-PCR法检测五种S1P受体的mRNA水平,综合评估开玄解毒除湿方对于鞘脂代谢的具体调节机制。5.开玄解毒除湿方参与银屑病HaCat细胞模型中鞘脂代谢的调节通过联合使用3种炎症因子(IL-17、IL-22、TNF-a,1:1:1,各40ng/ml)干预HaCat细胞48h的方法建立银屑病细胞模型。同时制备大鼠含药血清,使用MTT法确定含药血清干预浓度、筛选山奈酚及FTY720干预模型的浓度。随后采用WB法检测胞间连接蛋白、NF-κB信号通路蛋白,流式法检测细胞周期、q-PCR法检测炎症因子评估开玄解毒除湿方对于HaCat细胞模型的改善作用。最后通过免疫荧光法检测S1P、Cer含量、WB法检测鞘脂代谢相关蛋白SPHK、SPTLC2、ASAH1的含量、q-PCR法检测S1P受体的mRNA表达水平评估开玄解毒除湿方对鞘脂代谢的调节机制。研究结果:1.开玄解毒除湿方对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损的影响及安全性评价:(1)与空白组相比,开玄解毒除湿方能缓解银屑病小鼠体重下降的情况(P<0.05);(2)与模型组相比,开玄解毒除湿方能改善银屑病小鼠皮损红斑、鳞屑、浸润及PASI评分(P<0.01);(3)与模型组相比,开玄解毒除湿方能改善银屑病小鼠脏器指数(P<0.01)、毛细血管增生;(4)与模型组相比,开玄解毒除湿方能降低银屑病小鼠表皮厚度、PCNA阳性细胞数量(P<0.01);(5)与模型组相比,开玄解毒除湿方能提高银屑病小鼠皮损中Claudin-1、occludin蛋白含量(P<0.01);(6)与模型组相比,开玄解毒除湿方能降低银屑病小鼠皮损中p-NF-κB及p-IκBα含量(P<0.01);(7)与模型组相比,开玄解毒GSK2118436试剂除湿方能降低银屑病小鼠皮损及脾脏组织中CD3的含量;(8)与模型组相比,开玄解毒除湿方能降低银屑病小鼠血清中IL-17、IL-23含量(P<0.05);(9)肝肾组织HE染色显示各组间无明显病理学改变,ALT、AST、BUN无明显差异。2.靶向脂质组学检测开玄解毒除湿方对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损中鞘脂代谢产物含量对于Cer,相较于健康组小鼠,模型组小鼠中Cer总含量是升高的(P<0.05)。其中55种Cer在模型组小鼠皮损中的含量是升高的(P<0.05),15种Cer含量降低(P<0.05),12种含量变化不大(P>0.05)。与模型组相比,经过开玄解毒除湿方干预后,11种Cer含量含量降低(P<0.05),3种Cer含量升高。对于Sph及S1P,相较于健康组小鼠,Sph及S1P在模型组小鼠皮损中的含量均升高(P<0.05)。与模型组相比,经开玄解毒除湿方干预后,2种Sph含量降低(P<0.05),S1P含量下降(P<0.05)。对于SM,相较于健康组小鼠,SM在模型组小鼠皮损中的总含量未见明显升高或降低(P>0.Polymicrobial infection05)。其中5种SM在模型组小鼠皮损中的含量是升高的(P<0.05),11种SM含量降低(P<0.05),8种SM含量变化不大(P>0.05)。与模型组相比,经过开玄解毒除湿方干预后,有3种SM含量升高(P<0.05),2 种 SM 含量降低(P<0.05)。对于糖鞘脂,相较于健康组小鼠,GluCer、GalCer、LacCer在模型组小鼠皮损中的总含量可见明显升高(P<0.05)。对于GluCer,其中23种含量是升高的(P<0.05),1种含量变化不大(P>0.05);对于GalCer,19种含量明显升高(P<0.05),3种含量变化不大(P>0.05);对于LacCer,12种含量明显升高(P<0.05),4种含量变化不大(P>0.05)。与模型组相比,开玄解毒除湿方能够下调部分糖鞘脂的表达(P<0.05)。其中,GluCer14种,GalCer 5 种。3.基于网络药理学与分子对接预测开玄解毒除湿方治疗斑块型银屑病的潜在靶点中药方剂共筛选出69味活性成分,共266个潜在靶标;疾病共检索1201个靶标,交叉靶点为108个。构建的蛋白互作图中度值前三的靶点为TNF、Akt1和TP53。GO分析中,活性成分干预的生物过程包括基因表达、药物的反应、炎症反应、对缺氧/外源性刺激/脂多糖的反应和对凋亡Ceralasertib小鼠过程的正调控;干预的细胞成分主要与胞质溶胶、细胞质、细胞外空间、细胞外泌体、大分子复合物、染色体、膜筏等有关;干预的分子功能主要包括蛋白结合、酶结合、相同蛋白结合、细胞因子结合、转录辅因子结合、血红素结合等。通路富集分析中显示最相关信号通路为脂质和动脉粥样硬化信号通路(Lipid and atherosclerosis signaling pathway)。构建的“活性成分-靶点蛋白-通路”网络图中,排名前三的核心成分为槲皮素、木犀草素和山奈酚。将富集最相关通路中S1PRs分子与核心成分对接时,结果提示两者结合力较强,提示S1PRs可能是开玄解毒除湿方的潜在干预靶点。4.开玄解毒除湿方参与咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠皮损中鞘脂代谢的调节(1)与模型组相比,开玄解毒除湿方能降低银屑病皮损中S1P含量,升高银屑病小鼠皮损中Cer的含量(P<0.05);(2)与模型组相比,开玄解毒除湿方可降低银屑病皮损中鞘脂代谢调节酶SPHK1/2、SPTLC2及ASAH1的含量(P<0.05);(3)与模型组相比,开玄解毒除湿方可降低银屑病小鼠皮损中S1PR1-5的mRNA水平。5.开玄解毒除湿方参与银屑病HaCat细胞模型中鞘脂代谢的调节(1)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能抑制银屑病细胞模型的增殖(P<0.01);(2)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能增加银屑病细胞模型中紧密连接蛋白的含量(P<0.01);(3)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能降低银屑病细胞模型中处于G0/G1期细胞数量、提升S期细胞百分比(P<0.01);(4)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能降低银屑病细胞模型中p-NF-κB及p-IκBα含量(P<0.01);(5)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能降低银屑病细胞模型中IL-6、IL-8、TNF-α、CCL20四种炎症因子的mRNA水平(P<0.05);(6)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能降低银屑病细胞模型中S1P的含量,升高Cer的含量;(7)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能降低银屑病细胞模型中鞘脂代谢调节酶ASAH1、SPTLC2、SPHK1蛋白水平(P<0.01);(8)与模型组相比,开玄解毒除湿方含药血清能降低银屑病细胞模型中S1PR2的mRNA水平(P<0.05)。研究结论:1.开玄解毒除湿方能够显著改善银屑病模型小鼠局部皮损,包括修复皮肤屏障、抑制表皮增生、抑制NF-κB炎症信号通路、降低炎症因子、影响淋巴细胞分布。2.开玄解毒方安全性良好。3.斑块状银屑病中存在鞘脂代谢失衡现象,开玄解毒除湿方对于多种鞘脂代谢产物具有调节作用。4.开玄解毒除湿方能够通过干预相关鞘脂代谢产物水平(Cer、S1P)参与鞘脂代谢相关过程的调节。5.开玄解毒除湿方改善斑块状银屑病皮损的潜在机制可能与调节鞘脂代谢相关过程有关。