目的:由于C5AR1靶点在肿瘤的发生发展中具有促进作用,因此阻断C5AR1成为治疗肿瘤的新策略,导致C5AR1靶点药在不断发展中。为了降低C5AR1靶点药的开发成本,加快C5AR1靶点药的开发进程,开发一种用于验证人C5AR1靶点药的临床前验证用人源selleck Liproxstatin-1化小鼠模型迫在眉睫。本研究首先对构建的C5AR1人源化(hC5AR1)小鼠进行验证,然后为了构建一个C5a高表达适合肿瘤生长的环境,对C5/C5AR1人源化(hC5/hC5AR1)小鼠和高表达人源C5蛋白的小鼠结肠癌MC38细胞系(hC5 MC38)进行验证,最后由于免疫检查点抑制剂和C5AR1靶点药可以同时提高T细胞效应,抑制肿瘤生长,对PD-1/PD-L1/C5AR1人源化(hPD-1/hPD-L1/hC5AR1)小鼠和高表达人源PD-L1蛋白的MC38细胞系(hPD-L1 MC38)进行分析。同时依次将细胞系接种到人源化小鼠上,构建肿瘤模型,给予C5AR1抗体药,分析其药效,判断是否可以用来验证用于人的C5AR1靶点药的有效性和安全性。方法:1.C5a/C5AR1表达情况的分析:取培养的小鼠结肠癌细胞系(MC38细胞系)以及在C57BL/6野生型小鼠上接种MC38细胞系后,长到约100mm~3的肿瘤组织,使用流式细胞术检测肿瘤组织和MC38细胞系中鼠源C5AR1蛋白的表达;收集MC38细胞培养液上清和肿瘤组织匀浆液上清,使用ELISA检测补体C5a蛋白的表达。2.hC5AR1小鼠的分析。(1)hC5AR1小鼠的基因编辑策略:在野生型C57BL/6小鼠中,将小鼠的C5ar1基因替换为人的C5AR1基因。(2)C5AR1 m RNA的表达:取hC5AR1小鼠的骨髓,提取总RNA,进行反转录,选择合适的引物进行扩增。(3)C5AR1蛋白的表达:取hC5AR1小鼠的骨髓,采用流式细胞术,使用抗人的C5AR1抗体,分析人源C5AR1蛋白的表达。(4)免疫细胞分型实验:取hC5AR1小鼠的脾脏、外周血、淋巴结,采用流式细胞术,使用带有荧光标记的物种特异性抗体,分析T/B细胞、NK细胞、树突状细胞(DCs)、单核/巨噬细胞以及T细胞亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞的比例与野生鼠之间的差异。(5)肿瘤模型的构建与药效分析:将MC38细胞系接种到hC5AR1小鼠上,构建结肠癌动物模型,接种前一天进行分组并给药,每周两次称体重并且测量肿瘤体积观察肿瘤生长趋势,分析药效。3.hC5/hC5AR1小鼠的分析。(1)hC5/hC5AR1小鼠和hC5 MC38细胞系的基因编辑策略:在野生型C57BL/6小鼠中,将鼠源的C5基因替换为人源的C5基因,构建C5人源化(hC5)小鼠,然后将其与hC5AR1小鼠相互交配,获得hC5/hC5AR1小鼠;将MC38细胞系中鼠源的C5基因替换为人源的C5基因,构建hC5 MC38细胞系。(2)C5、C5AR1 m RNA的表达:取hC5/hC5AR1小鼠的肺组织,提取总RNA,进行反转录,分别选择合适的引物进行扩增。(3)C5、C5AR1、C5a蛋白的表达:取hC5/hC5AR1小鼠的骨髓,采用流式细胞术,使用抗人的C5AR1抗体,分析人源C5AR1蛋白的表达;取hC5/hC5AR1小鼠的血清,使用ELISA试剂盒分析C5、C5a蛋白的表达;取hC5 MC38细胞的培养上清液,使用ELISA试剂盒分析人源C5蛋白的表达。(4)免疫细胞分型实验:取hC5/hC5AR1小鼠的脾脏、外周血、淋巴结进行分析,方法同hC5AR1小鼠。(5)肿瘤模型的构建与药效分析:将hC5 MC38细胞系接种到hC5/hC5AR1小鼠上,构建结肠癌动物模型,待肿瘤体积达到100-150 mm~3时进行分组给药,每周两次称体重并测量肿瘤体积,分析药效。4.hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠的分析。(1)hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠和hPD-L1 MC38细胞系的基因编辑策略:在野生型C57BL/6小鼠中,将鼠源的PD-1基因替换为人源的PD-1基因,构建PD-1人源化(hPD-1)小鼠,将鼠源的PD-L1基因替换为人源的PD-L1基因,构建PD-L1人源化(hPD-L1)小鼠,将两种小鼠相互交配,获得PD-1/PD-L1人源化(hPD-1/hPD-L1)小鼠,最后将hC5AR1小鼠与hPD-1/hPD-L1小鼠交配,获得hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠;将MC38细胞系中鼠源的PD-L1基因替换为人源的PD-L1基因,构建hPD-L1 MC38细胞系。(2)PD-1、PD-L1、C5AR1蛋白的表达:取hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠的骨髓,采用流式细胞术,使用抗人的C5AR1抗体,分析人源C5AR1蛋白的表达;取经过抗鼠的CD3抗体刺激24 h后的hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠的脾脏,采用流式细胞术,使用抗人的PD-1、PD-L1抗体,分析人源PD-1、PD-L1蛋白的表达;取hPD-L1 MC38细胞,采用流式细胞术,使用抗人的PD-L1抗体,分析人源PD-L1蛋白的表达。(3)免疫细胞分型实验:取hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠的脾脏、外周血和淋巴结,方法同hC5/hC5AR1小鼠。(4)抗体结合实验、肿瘤模型的构建与药效分析:通过流式细胞术分析内部合成的阳性药Avdoralimab与hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠的结合能力;将hPD-L1 MC38细胞系接种到hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠上,构建结肠癌动物模型,其他方法同hC5/hC5AR1小鼠。结果:1.C5a/C5AR1表达情况的分析:C5a在肿瘤组织匀浆液上清中表达,C5AR1在肿瘤组织中的CD45+的细胞中表达,说明C5AR1在肿瘤组织微环境中的免疫细胞中表达,而不是肿瘤细胞。2.hC5CCRG 81045试剂AR1小鼠的分析。(1)hC5AR1小鼠通过基因型鉴定确认获得基因编辑成功的阳性鼠。(2)hC5AR1小鼠只表达人C5AR1的m RNA,不表达小鼠C5AR1的m RNA。(3)hC5AR1小鼠只表达人C5AR1蛋白,不表达小鼠C5AR1蛋白。(4)以野生鼠作为对照,hC5AR1小鼠中脾脏、淋巴结、外周血中的T/B细胞、NK细胞、树突状细胞(DCs)、单核/巨噬细胞以及T细胞亚群CD4+T细胞、CStudents medicalD8+T细胞、Treg细胞的比例与野生鼠无显著性差异。(5)hC5AR1小鼠的肿瘤模型构建成功,但没有明显的药效。3.hC5/hC5AR1小鼠的分析。(1)hC5/hC5AR1小鼠和hC5 MC38细胞系通过基因型鉴定确认获得基因编辑成功的阳性鼠和阳性克隆。(2)hC5/hC5AR1小鼠只表达人源C5、C5AR1的m RNA,不表达鼠源C5、C5AR1的m RNA。(3)hC5/hC5AR1小鼠只表达人源的C5、C5a、C5AR1蛋白,不表达鼠源的C5、C5a、C5AR1蛋白;在hC5 MC38细胞系的培养上清中检测到人源C5蛋白。(4)以野生鼠作对照,hC5/hC5AR1小鼠中脾脏、淋巴结、外周血中的各免疫细胞比例与野生鼠无显著性差异。(5)hC5/hC5AR1小鼠的肿瘤模型构建成功,但没有药效。4.hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠的分析。(1)hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠和hPD-L1 MC38细胞系通过基因型鉴定确认获得基因编辑成功的阳性鼠和阳性克隆。(2)hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠只表达人源的PD-1、PD-L1、C5AR1蛋白,不表达鼠源的PD-1、PD-L1、C5AR1蛋白;在hPD-L1 MC38细胞系中也检测到人源的PD-L1蛋白。(3)以野生鼠作对照,hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠中脾脏、淋巴结、外周血中的各免疫细胞比例与野生鼠无显著性差异。(4)抗人C5AR1抗体药Avdoralimab只与hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠特异性结合,不与野生鼠结合。hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠的肿瘤模型构建成功,与单药相比,联合使用抗人PD-1抗体和抗人C5AR1抗体能更有效地抑制肿瘤的生长。结论:对基因型已经鉴定成功的hC5AR1小鼠、hC5/hC5AR1小鼠、hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠以及hC5 MC38细胞系、hPD-L1 MC38细胞系进行分析,发现这三种人源化小鼠以及这两种细胞系都构建成功。以这三种人源化小鼠和人源化细胞系为基础,构建肿瘤模型,结果显示:抗人C5AR1抗体单药无论在hC5AR1小鼠肿瘤模型还是在hC5/hC5AR1小鼠肿瘤模型中都没有获得药物有效性的数据;但联合使用抗人PD-1抗体和抗人C5AR1抗体在hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠肿瘤模型中获得了药物有效性的数据,证明药物联用能有效抑制肿瘤的生长,hPD-1/hPD-L1/hC5AR1小鼠可以作为C5AR1靶点药的临床前药效验证模型,对加速C5AR1靶点药的开发进程有一定的意义。