猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPFour medical treatisesV)是引起初孕母猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一。PPV基因组含有两个开放阅读框ORF1和ORF2,其中ORF1编码非结构蛋白NS1和NS2,NS1的主要功能是参与转录调控和病毒复制,NS2的主要功能是参与病毒复制和出核过程。研究发现,编码NS2的基因包含于编码NS1的基因内,NS2-mRNA是NS1-mRNA经可变剪接而形成,但其具体机制尚不清楚。核不均一核糖核蛋白(Heterogenous nuclear ribonucleo proteins,hnRNPs)是一类在多种细胞内广谱表达且高度保守的多功能蛋白,能够作为剪接调控因子参与多种病毒mRNA的剪接,该家族成员可能参与PPV NS1-mRNA剪接形成PPV NS2-mRNA的过程。本研究拟从与PPV NS1-mRNA的互作宿主蛋白中筛选并鉴定hnRNPs,通过干扰、敲除和过表达,研究hnRNPs在PPV NS2-mRNA形成过程中的作用及对PPV复制的影响,进一步鉴定hnRNPs作用于PPVNS1-mRNA的剪接位点,构建突变型PPV毒株,探讨该位点突变对PPV复制的影响。研究结果旨在阐明PPVNS1-mRNA剪接形成PPVNS2-mRNA的机制,为进一步揭示PPV复制机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.PPV NS1-mRNA与宿主蛋白hnRNPK互作根据PPV NS1-mRNA互作宿主蛋白的质谱检测结果,筛选出与PPV NS1-mRNA互作的hnRNPs家族成员hnRNPK,构建hnRNPK真核表达载体,将其转染PK-15细胞24 h后提取细胞核蛋白,与生物素标记的PPV NS1-mRNA共孵育,RNA-pulldown检测结果显示,PPVNS1-mRNA和hnRNPK存在互作。进一步利用hnRNPK抗体进行蛋白质-RNA免疫共沉淀,结果显示,PPVNS1-mRNA和hnRNPK存在互作。在PPV感染的PK-15细胞中,分别用hnRNPK抗体和原位杂交探针标记hnRNPK和PPVNS1-mRNA,激光共聚焦结果显示,PPVNS1-mRNA 和 hnRNPK 共定位于细胞质。2.hnRNPK 促进 PPV NS2-mRNA 形成及 PPV 复制分别以1 MOI PPV感染PK-15细胞,0h、12 h、24h和36h后收集细胞,western blotting和qPCR检测hnRNPK的蛋白和mRNA水平,结果显示,与MOCK组相比,PPV感染12 h后hnRNPK的蛋白水平和mRNA水平显著升高(P<0.05),感染36 h后hnRNPK的蛋白水平和mRNA水平极显著升高(P<0.01)。设计并合成3个针对hnrnpk的特异性 siRNA,命名为 si-hnrnpk-270、si-hnrnpk-600和si-hnrnpk-1090,分别转染PK-15细胞36 h后,qPCR和western blotting检测发现,与对照si-NC组相比,si-hnrnpk-600能极显著抑制hnRNPK的mRNA和蛋白表达(P<0.01)。将si-hnrnpk-600转染PK-15细胞36h后,以1 MOI PPV感染细胞24h,PCR检测发现,PPVNS2-mRNA水平相比si-N点击此处C组极显著降低(P<0.01),qPCR检测发现,PPV DNA拷贝数显著降低(P<0.05)。进一步利用CRISPER/Cas9系统构建hnrnpk敲除细胞系PK-15hnrnpk-/-,细胞活性检测结果显示,hnrnpk敲除对PK-15细胞生长活性影响不显著(P>0.05)。以 1 MOI PPV 感染 PK-15hnrnpk-/-细胞 24 h,检测PPVNS2-mRNA 的形成、PPV DNA拷贝数及TCID50,结果显示,与野生型细胞及未敲除细胞相比,PK-15hnrnpk-/-细胞内PPVNS2-mRNA水平极显著降低(P<0.01),PPVDNA拷贝数和TCID50极显著降低(P<0.01)。在PK-15细胞中共转染NS1和hnRNPK的表达载体,western blotting和qPCR检测NS1的蛋白表达和mRNA水平,以及NS2的mRNA水平,结果显示,共转染hnRNPK后,PPV NS1的蛋白和mRNA水平极显著降低(P<0.01),而PPV NS2的mRNA水平显著升高(P<0.05),且呈浓度依赖性。3.hnRNPK作用于PPVNS1-mRNA 3'末端剪接位点调控PPVNS2-mRNA的形成构建3'末端和5'末端剪接位点突变的PPV NS1表达载体NS1(pC-Mut)和NS1(pN-Mut)。分别将野生型 NS1、NS1(pC-Mut)和 NS1(pN-Mut)与 hnRNPK 共转染PK-15细胞24 h后,检测NS1的表达及NS2-mRNA的形成,结果显示,与野生型NS1组及NS1(pN-Mut)组相比,过表达hnRNPK对NS1(pC-Mut)组细胞中NS1的表达影响差异不显著(P>0.05),但NS2-mRNA形成显著减少(P<0.05)。构建PPV NS点击此处1 3’末端剪接位点突变的PPV感染性克隆质粒,转染PK-15细胞并连续盲传5代进行病毒拯救,PCR和测序鉴定病毒拯救成功,命名为PPVpCmut。分别用1 MOI的PPVpCmut和野生型PPV感染PK-15细胞24 h后,检测PPVNS2-mRNA的形成、PPVDNA拷贝数和TCID50,结果显示,与野生型PPV感染细胞相比,PPVpCmut感染细胞中NS2 mRNA水平、DNA拷贝数和TCID50均极显著降低(P<0.01)。本研究筛选并鉴定得到PPVNS1-mRNA的互作宿主蛋白hnRNPK。通过干扰和敲除hnrnpk,以及在PK-15细胞中共转染NS1和hnRNPK的表达载体研究发现,hnRNPK通过是促进PPVNS2-mRNA的形成从而促进了 PPV的复制。进一步研究发现,hnRNPK作用于PPV NS1-mRNA的3'末端剪接位点进而调控PPV NS2-mRNA的形成。构建剪接位点突变毒株PPVpCmut研究发现,剪接位点突变后PPVNS2-mRNA形成和病毒复制水平均极显著降低。研究结果阐明PPV通过与宿主蛋白hnRNPK互作进而促进NS1-mRNA 剪接形成 NS2-mRNA 的机制,为进一步揭示 PPV 复制机制提供理论依据。