目的:糖尿病肾脏疾病(Diabetic kidney disease,DKD)是一种由糖尿病(Diabetes mellitus,DM)引起的慢性肾脏病,是引起终末期肾脏疾病的主要原因。肠道黏膜屏障在糖尿病、肾脏疾病的发生发展中起着重要作用,肠道黏膜屏障受损会导致细菌易位,肠腔中的毒素进入机体,诱发慢性系统炎症,影响肾脏健康。石榴中的多酚安石榴苷(Punicalagin,PU)具有潜在地影响微生物生态系统、肠道黏膜屏障和肾功能的作用。本研究拟通过人群研究探讨糖尿病患者肠道屏障功能与DKD发生风险的关联,并在动物实验中进一步探讨PU是否通过调控肠道黏膜屏障改善DKD小鼠肾损伤。方法:1.人群研究:采用整群抽样的方法开展横断面研究,根据美国糖尿病学会制定的DM临床诊断标准,纳入青岛市年龄≥65岁农村社区的DM患者为研究对象,再根据中华医学会肾脏病学分会制定的DKD的临床标准分为糖尿病非肾脏疾病组(Diabetic non-kidney disease,DNKD)和DKD组。收集一般人口学特征,采用全自动生化分析仪检测血清空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(Serum creatinine,Scr),采用全自动血细胞分析仪检测白细胞计数、中性粒细胞计数和淋巴细胞计数等指标。采用肾脏病饮食调整研究(Modification of Diet in Renal Disease,MDRD)公式计算肾小球滤过率(Estimated glomerular filtration rate,e GFR),通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测患者肠道屏障功能指标,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharide-binding protein,LBP)、二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)和连蛋白zonulin水平,通过Spearman相关性分析评价肠道屏障功能指标selleckchem RSL3与e GFR的相关性,采用条件logistic回归模型计算比值比(Odds ratio,OR)和95%可信区间(Confidence interval,CI)来评估肠道屏障功能与DKD发生风险的关联性。2.动物研究:建立高脂饮食诱导的DKD小鼠模型,C57BL/6J小鼠随机分为5组(15只/组):健康对照组(Normal control,NC)、DKD模型组(DKD);二甲双胍组(Metformin,MET);低剂量安石榴苷组(Low-dose of PU,LPU);高剂量安石榴苷组(High-dose of PU,HPU),NC组和DKD组每天给予生理盐水灌胃,MET组每天给予150 mg/kg/day的二甲双胍水溶液灌胃,LPU组每天给予50 mg/kg/day的PU水溶液灌胃,HPU组每天给予100 mg/kg/day的PU水溶液灌胃,干预持续8周后进行腹腔注射葡萄糖耐量实验,实验结束后小鼠静养5天后处死,留取血液、结肠、肾脏组织进行后续指标检测,通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H&E)染色观察小鼠结肠和肾脏的病理性变化,采用ELISA实验检测小鼠血清中胰岛素(Insulin,INS)、TC、TG、LDL-C、HDL-C、BUN、Scr、尿酸、LPS和DAO,以及肾脏组织中炎症因子和趋化因子的表达水平。通过免疫组化检测肾脏中肾母细胞瘤1(Wilms tumor 1,WT-1)Adavosertib抑制剂的表达水平,免疫荧光检测结肠中肠道紧密连接蛋白如胞质紧密粘连蛋白1(Zonula occludens-1,ZO-1)和occludin的表达水平。通过16S r RNA测序和气相色谱-质谱联用仪来检测肠道微生物构成和短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)水平,并进行肾脏RNA测序分析如差异表达的基因及其京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。结果:1.人群研究:(1)本研究共纳入DM患者(年龄≥65岁)202名,其中DNKD组127名和DKD组75名。DKD组的男性人数占比为23%,冠心病和高脂血症人数占比分别为10%和7%,均显著高于DNKD组(P<0.05)。DKD组患者的FBG、TG、BUN和Scr水平、尿蛋白阳性人数、白细胞计数、中性粒细胞计数和中性粒细胞计数/淋巴细胞计数(Neutrophil to lymphocyte ratio,NLR)水平,以及肠道屏障指标LPS、LBP、DAO和zonulin水平均显著高于DNKD组(P均<0.05),而DKD组患者的e GFR水平显著低于DNKD组(P<0.001)。(2)经Spearman相关性分析发现LPS(r=-0.248,P<0.001)、LBP(r=-0.240,P<0.001)、DAO(r=-0.324,P<0.001)和zonulin(r=-0.231,P<0.001)与e GFR均呈显著负相关。Logistic回归分析发现LPS、LBP、DAO和zonulin的浓度与DKD的发生风险呈正相关(P_(趋势性)均<0.05)。以各指标的T1分位(最低分位)作为参照,调整混杂因素(性别、高脂血症史、冠心病史、FBG、TG、白细胞计数、中性粒细胞计数和NLR后,LPS的T2分位(OR:2.753;95%CI:1.115,6.795)和T3分位(OR:7.130;95%CI:2.917,17.425)与DKD的发生风险呈正相关;DAO的T3分位(OR:6.079;95%CI:2.664,13.873)与DKD的发生风险呈正相关;zonulin的T3分位(OR:2.885;95%CI:1.290,6.451)与DKD的发生风险呈正相关,且线性趋势性检验均有统计学意义(P_(趋势性)<0.05)。2.动物研究:(1)与DKD模型组相比,PU组小鼠的体重、FBG、INS、TC、TG、LDL-C水平较低;补充PU可以改善肾脏结构和功能,PU组小鼠的Scr、UA和BUN的水平显著低于DKD组。(2)PU改善了DKD小鼠的肠道形态和肠道通透性,PU组小鼠的血清LPS和DAO的水平显著低于DKD组。与DKD模型组相比,PU组小鼠的ZO-1和occludin的表达水平较高。PU干预后重塑肠道微生物构成,增加了SCFAs产生菌(如Akkermansia和Eubacterium＿coprostanoligenes＿group)的丰度,进一步分析发现PU组小鼠的肠道SCFAs的水平高于DKD组。(3)通过RNA测序探究差异表达的基因,发现PU干预后逆转了炎症相关的信号通路,如细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、趋化因子信号通路、NOD样受体信号通路和肿瘤坏死因子信号通路,PU组小鼠的炎症相关基因,如CXC型趋化因子配体2(CXC motif chemokine ligand 2,CXCL2)和CXC型趋化因子配体3(CXC motif chemokine ligand 3,CXCL3)等基因,炎性细胞因子如NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)、白介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)等基因的表达水平都低于DKD模型组。(4)与DKD模型组相比,PU组小鼠的肾脏趋化因子CXCL2、CXCL3、NLRP3和IL-1α的水平较低,Spearman相关分析发现,肠道屏障功能完整性指标如ZO-1和occludin与肾脏的趋化因子和炎性因子呈明显负相关。结论:1.人群研究:横断面研究发现DM患者肠道屏障功能受损与DKD发生风险呈正相关。2.动物研究:研究表明PU通过调节肠道菌群构成如增加SCFAs产生菌的丰度,Community media增加SCFAs的生成,改善肠道形态和肠道通透性来修复肠道黏膜屏障受损。PU进一步通过调控肠道黏膜屏障来减轻DKD。