大豆(Glycine max)是一种重要的经济作物。目前人工成规模种植的品种主要是栽培大豆,它们由野生大豆(Glycine soja)驯化而来。从野生大豆祖先驯化形成现代栽培大豆的过程中,种皮颜色发生了显著的变化。叶绿素与花青素是造成种皮颜色差异的主要原因,叶绿素决定绿色种皮,花青素决定深色种皮。越来越多的研究表明,长期食用花青素或富含花青素的食物对健康有一系列的好处。此外,大豆种皮颜色是一种非常便于观察的生物学性状,是遗传学研究中常用的标记。使用不同的颜色来标记区分用于制药、食品饲料加工等商业用途的大豆PEG300将有望极大地降低原料筛选成本。因此,掌握大豆种皮颜色的形成机制具有重要意义。现有的研究表明大豆种皮颜色受到多个位点的影响,这些位点大多是花青素生物合成途径的关键酶和转录因子。但现有的研究仍无法完美解释种皮颜色的成因。对种皮显色过程中花青素变化的研究以及发掘新的种皮颜色影响基因为解决这一问题提供了可能。目前,对种皮花青素研究的对象基本为成熟种子,而对种皮发育过程中花青素成分和含量变化的研究鲜见报道。本研究利用超高效液相色谱串联质谱(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-ESI-MS/MS)检测黄色种皮大豆绥农14(SN14)和红色种皮大豆泰兴矮脚红(TXAJH)不同发育阶段种皮的花青素成分与含量,解析种皮呈现红色的分子基础;利用SN14和TXAJH杂交构建的重组自交系(Recombinant inbred lines,RIL)进行分离分组混合分析(Bulked segregant analysis,BSA),初步定位红色种皮相关基因的候选区域;在此基础上结合精细定位和基因表达水平分析,最终预测了红色种皮候选基因。具体研究成果如下:1、不同颜色种皮的花青素成分存在差异花青素检测结果表明,SN14和TXAJH在开花后第40、50、60和70天的种皮中共产生了12种花青素。在含量上,TXAJH种皮花青素的含量在种皮颜色由绿变红的过程中迅速升高并趋于稳定,而SN14种皮花青素的含量在种皮颜色由绿变黄的过程中连续下降,且显著低于同时期的TXAJH。在成分上,TXAJH开花后第70天的种皮中含量最高的三种花青素分别是矢车菊素-3-O-葡糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside,Cy-3-glu)、芍药花素-3-O-葡糖苷(Peonidin-3-O-glucoside,Pn-3-glu)和牵牛花素-3-O-葡萄糖苷(Petunidin-3-O-glucoside,Pt-3-glu),它们分别占该时期种皮花青素总量的47%、37%和12%;同一时期在SN14种皮中含量最高的三种花青素分别是矢车菊素(Cyanidin,Cy)(76%)、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(Pelargonidin-3-O-beta-D-glucoside,Pg-3-glu)(21%)和锦葵色素-3-O-葡萄糖苷(Malvidin-3-O-glucoside,Mv-3-glu)(3%)。对比该时期两组花青素的绝对含量,TXAJH三种花青素含量总和是SN14的200倍以上。表明Cy-3-glu、Pn-3-glu和Pt-3-glu是导致TXAJH种皮显现红色的主要原因。2、BSA-seq定位种皮色基因候选区间在RIL群体中分别构建了红色种皮和黄色种皮的基因混池,与亲本一起进行全基因组BSA-seq,最后以大豆参考基因组Wm82.a2.v1为模板对测序数据进行组装。变异位点韦恩统计显示共有2285504个SNP变异位点和501857个In Del变异位点可能与种皮颜色差异相关。利用欧式距离(Euclidean distance,ED)算法和index算法进行关联分析,将红色种皮候选区间初步定位于第8号染色体上,长度为8.66 Mb,包含1127个基因。该区间内有308个基因在亲本之间存在非同义变异,36个基因存在移码变异。GO富集分析结果表明这些变异基因的表达产物主要存在于细胞内有膜细胞器和细胞质以及蛋白酶体复合体中,具有转移酶活性和蛋白激酶活性,参与对花粉和辅酶的识别等生物过程。KEGG富集结果表明变异基因主要参与生物体的新陈代谢过程,并在类黄酮生物合成、植物昼夜节律和核黄素代谢途径显著富集。其中,类黄酮生物合成途径富集最为显著,表明候选区间内的相关基因可通过参与类黄酮生物合成途径来影响种皮的颜色。3、精细定位预测了4个红色种皮候选基因在BSA-seq初定位区间基础上进行精细定位,利用27个多态性标记进行连锁分析得到10种单倍型,将候选区间缩小至702 kb。区间内有37个基因在亲本间存在非同义变异。基因功能注释发现其中4个基因与类黄酮生物合成途径有关:Glyma.08g059900与MYB转录因子相关,Glyma.08g061300和Glyma.08g063900与b HLH转录因子相关,Glyma.08g062000为花青素还原酶1基因(ANR1)。基因表达结果显示,种皮发育过程中它们在TXAJH种皮中的表达水平明显高于同时期的SN14。不同时期种皮的基因表达水平和主要花青素含量的关联分析发现,Cy和Mv-3-glu的含量与候选基因表达水平负相关,Cy-3-glu、Pg-3-glu、Pn-3-glu和Pt-3-glu的含量与候选基因表达水平正相关且与Glyma.08g059900和GlymaSpine biomechanics.08g061300的表达水平具有显著的关联,表明候选基因表达水平与花青素含量之间存在极强的相关性。此外,TXAJH种皮中花青素合成途径相关结构基因的表达水平同样显著高于SN14。暗示Glyma.08g059900、Glyma.08g061300和Glyma.08g063900可能对这些结构基因产生了调控作用并促进了TXAJH种皮中花青素的合成与积累。综上,本研究最终预测Glyma.08g059900,Glyma.08g061300,Glyma.08g062000和Glyma.08g063900为红色种FUT-175细胞培养皮候选基因。