阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)因其高患病率、高死亡率及缺乏有效的治疗药物,已成为困扰人类脑健康的重要问题。研究发现,线粒体功能障碍是AD最显著的特征之一,并与促进AD进展的能量代谢受损、氧化应激损伤、自噬障碍及Aβ沉积等密切相关。而线粒体移植作为一种重塑线粒体功能的疗法,在神经退行性疾病中进行了广泛的研究,并证实可以改善老年老鼠的认知和运动功能,但其在AD中的作用和机制尚不清楚。另有研究报道,沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)的表达与AD的神经病理学变化呈负相关。SIRT1是一种组蛋白去乙酰化酶,其激活依赖于NAD~+/NADH水平。NAD~+、NADH是线粒体中重要的氧化还原调节剂,NAD~+/NADH的比值与线粒体的功能和活性密切相关。因此,SIRT1是否参与线粒体移植治疗的益处,并调控AD进展,尚不明确。本课题拟研究外源线粒体对AD的认知改善作用及机制,并探究SIRT1在线粒体治疗中的作用,为AD的治疗提供一种新方法。在体外实验中,首先对提取的线粒体进行了线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、电子传递链(electron tGlaucoma medicationsransport chain,ETC)复合物及电镜检测。结果显示线粒体形态结构完整、膜电位较高、活性良好。随后,采用β-淀粉样肽1-42(Aβ_(1-42))处理SH-SY5Y细胞,构建了Aβ损伤的AD细胞模型,并使用阿尔玛蓝检测了外源线粒体对Aβ损伤细胞活力的影响。结果发现线粒体浓度在50﹣300μg/m L时,Aβ损伤细胞的活力随线粒体浓度的增加而增强,并呈时间和剂量依赖性。当以200μg/m L的线粒体处理4 h后,Aβ损伤细胞的活力显著提高。为了探究外源线粒体对Aβ损伤细胞的作用机制,对三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)、ETC及氧化还原相关指标进行了测定。结果显示,线粒体组丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase,PDH)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase,α-KGDH)、线粒体异柠檬酸脱氢酶(mitochondrial isocitrate dehydrogenase,ICDHm)、线粒体复合物Q-VD-Oph半抑制浓度I﹣IV活性及ATP/ADP比值显著提高。此外,线粒体组NAD~+/NADH比值、还原性谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性也明显增加,活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平显著降低。结果表明外源线粒体移植可以促进线粒体功能,改善能量代谢;同时还可通过提高GSH-Px、SOD活性,增加NAD~+/NADH、GSH/GSSG比值来增强细胞的抗氧化能力,抑制氧化应激,降低ROS水平,从而改善氧化还原失衡。随后,通过转录组学研究了外源线粒体对Aβ损伤细胞的作用机制。实验将线粒体组细胞与Aβ损伤细胞m RNA进行了对比,并通过GO与KEGG富集及具体差异表达基因分析,发现了与神经元生长、修复、连接及细胞自噬相关的基因在线粒体作用前后存在显著差异,并找到了差异表达的关键基因SIRT1。由于SIRT1是线粒体NAD~+信号逆向调控的关键蛋白,因此,我们推测外源线粒体可能通过激活NAD~+/NADH依赖的SIRT1的活性,从而调控下游神经营养因子和自噬蛋白,发挥神经元保护作用并清除受损线粒体及错误折叠的蛋白质。为了进一步研究作用机制,并探究SIRT1是否在线粒体移植治疗中发挥重要作用,实验测定了SIRT1的活性,并采用电镜检测了外源线粒体作用前后Aβ损伤细胞中线粒体的变化以及使用免疫荧光法测定了细胞中SIRT1、BDNF及Aβ的表达。此外,还采用了免疫印迹法(western blot,WB)对神经元生长、修复、连接及细胞自噬相关蛋白的表达量进行了测定。结果显示,线粒体作用后SIRT1的活性及BDNF的表达量显著提高,Aβ的表达量显著降低;且作用后Aβ损伤细胞内线粒体形态恢复正常,数量增加,并出现了自噬现象;此外,WB结果显示,线粒体能够上调SIRT1下游FOXO3、BNIP3、LC3II/LC3I、BDNF、p-ERK/ERK蛋白的表达量。这些结果表明外源线粒体可能通过SIRT1/FOXO3/BNIP3/LC3途径促进自噬,有效清除受损的细胞器和Aβ;同时,线粒体还可能通过SIRT1/BDNF/ERK途径调节神经元细胞的生长、修复及神经元间的连接,增强突出可塑性。在体内实验中,将Aβ_(1-42)注射于小鼠双侧海马构建AD小鼠模型。通过尾静脉注射线粒体连续治疗4天后,使用Morris水迷宫对小鼠认知和学习记忆能力进行测试,同时采用硫磺素T对小鼠脑海马区域Aβ进行染色。结果发现线粒体治疗后,小鼠逃逸潜伏期显著缩短,行动轨迹更集中于目标象限,且在目标象限停留时间显著延长。此外线粒体组小鼠海马区域Aβ沉积显著减少,结果充分说明外源线粒体可以改善AD小鼠的学习和认知记忆能力,减少Aβ沉积,缓解AD进展。为了确定线粒体对动物的认知改善机制。首先,对TCA循环、ETC及氧化还原相关指标进行了测定。结果显示,外源线粒体能够提高α-KGDH、SDH、线粒体复合物I和IV的活性,并提高ATP/ADP、NAD~+/NADH、GSH/GSSG比值,降低ROS水平。这些结果与细胞实验结果一致,充分说明外源线粒体能够促进线粒体功能,改善能量代谢,增加抗氧化能力,降低ROS水平,减轻氧化应激损伤。其次,对小鼠脑海马组织中SIRT1的活性进行了测定,并采用WB测定了SIRT1下游FOXO3、BNIP3、LC3II/LC3I、BDNF、p-ERK/ERK蛋白的表达量。结果显示,线粒体治疗后SIRT1活性显著增加,且SIRT1的激活上调了FOXO3及其下游自噬蛋白BNIP3、LC3II/LC3I的表达。此外,SIRT1活性的增加还上调了BDNF、p-ERK/ERK蛋白的表达量。综上所述,实验结果表明线粒体移植治疗可改善阿尔茨海默症模型小鼠的认知功能,减少Aβ沉积。同时,线粒体移植还可修复线粒体功能,提高细胞内ATP/ADP,改善能量代谢,增加抗氧化能力,降低ROS水平,抑制氧化应激,改善氧化还原失衡。并且,结果还揭示了线粒体可能通过SIRT1/FOXO3/BNIP3/LC3途径促进自噬,有效清除受损的细胞器和错误折叠的蛋白质。此外,研究还阐明了线粒体可能通过SIRT1/BDNF/ERK途径调SB431542生产商节神经元的生长、修复及神经元间的连接,增加突触可塑性,增强学习记忆能力,改善AD症状。