肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种致死性的神经系统退行性疾病,其特征是上下运动神经元的进行性死亡,通常在确诊后3-5年出现呼吸衰竭而死亡。ALS目前病因尚不完全明确,可能涉及遗传和非遗传因素。目前已经发现160多种基因突变与ALS发生有关,FUT-175化学结构其中,Cu/Zn 超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase,SOD 1)基因是最早发现也是最常见的基因改变位点之一,约占家族性病例的12%和散发性病例的1%。在携带SOD1基因突变的患者和动物模型中,突变的SOD1蛋白在运动神经元聚集是最常见的病理特征之一。其他的病理特征主要包括:神经炎症、线粒体功能障碍、RNA加工和代谢受损、神经营养因子缺乏、轴浆转运异常。自噬是真核细胞中异常蛋白聚集体降解的主要途径,在多种神经系统退行性疾病中扮演重要角色。据报道,ALS患者及SOD1G93A转基因小鼠存在自噬异常,并且一些调控自噬的手段已经在ALS中显示出积极结果,这提示改善自噬功能促进病理性蛋白聚集体降解是ALS的治疗策略之一。近年来,肠道微生物组-肠道-脑轴在神经系统疾病的作用引起人们重视。现有的证据表明多种神经系统疾病会常伴随肠道结构功能异常及微生物组失衡,调控肠道微生物组可以通过多种直接途径和间接途径调节肠道及中枢神经系统功能。先前的研究显示ALS小鼠模型发病前期便存在菌群失调,给予ALS小鼠模型补充某些特定菌群以及代谢产物有利于改善运动功能并延长生存期。另外,在C9orf72缺陷型小鼠中的研究发现肠道菌群是其系统性炎症和神经炎症的关键调节因素。这些发现均提示肠道菌群与ALS疾病之间存在关联。益生菌是一种可以调节肠道微生物区系组成和代谢/免疫活性的有效并安全的物质。在多数情况下,补充益生菌可导致粪便和血清中短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)水平的升高,这些微生物代谢物参与调节肠道和远隔器官(包括肝脏、脂肪组织、肌肉和大脑)的多种代谢途径,它们可以通过调节能量代谢和稳态、炎症和免疫对健康产生积极影响。另外,有研究显示SCFAs与自噬关系密切,其可通过调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路或组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)活性参与自噬调控。在表现出上述特征的细菌菌株中,有几种属于嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌和粪肠球菌。有趣的是,在几种神经系统退行性疾病中,特定的益生菌已被报道可以调节肠道微生物区系,抑制小胶质细胞激活和神经炎症反应,减少异常蛋白的聚集并减缓疾病进展,这些研究增加了益生菌作为ALS有效治疗策略的可能性。在本研究中,我们首先通过免疫荧光、蛋白印迹等方法探索了 SOD1 G93A小鼠肠道的结构改变及病理特点,并应用了一种由嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌和粪肠球菌3株菌混合而成的复合益生菌制剂(本研究中简写为LBE)调控SOD1-ALS转基因小鼠模型的肠道菌群组成,观察复合益生菌制剂对SOD1-ALS转基因小鼠模型运动功能及生存期的影响,并通过免疫荧光、蛋白印迹、16s rDNA测序、气相色谱分析等方法观察益生菌制剂对SOD1G93A小鼠肠道及脊髓病理、肠道菌群组成及血清短链脂肪酸浓度的影响并对可能的作用机制进行了初步探索。最后,我们利用ALS动物及细胞模型对可能发挥有利作用的菌群代谢产物进行了验证,并对该代谢产物可能的作用机制进行了深入探索。第一部分 复合益生菌制剂改善SOD1G93A小鼠的肠道及脊髓病理并延长其生存期及机制探索目的:探讨肌萎缩侧索硬化症SOD1G93A转基因小鼠模型肠道结构改变及病理特点。观察复合益生菌制剂对SOD1G93A小鼠肠道及脊髓病理以及生存期的影响并分析复合益生菌制剂对小鼠肠道菌群及血清菌群代谢产物的影响,随后进一步探索复合益生菌制剂对ALS疾病的保护机制。方法:我们将购自美国Jackson实验室的雄性半合子携带[B6SJL-T g(SOD1-G93A)1Gur/J]小鼠和雌性B6SJL/F1小鼠进行杂交,通过P CR确定后代小鼠的基因型。选择40、90、120日龄雌性SOD1G93A小鼠和同窝野生型(Wild-type,WT)小鼠进行实验,采用碳末推进实验观察两组小鼠不同疾病时期的肠动力,并在麻醉后取材回肠、结肠和脊髓。采用免疫荧光、蛋白印迹等方式观察两组小鼠不同疾病时期肠道粘膜屏障功能、肠道炎性反应、肠神经系统病理改变(包括肠神经元数量、胶质细胞增生、促凋亡蛋白及异常SOD1蛋白的积累)以及脊髓病理改变(包括脊髓神经元、促凋亡蛋白及异常SOD1蛋白的积累、胶质细胞增生)。随后,将SOD1G93A小鼠随机分为两组:益生菌复合制剂组(G93A-LBE)和赋形剂组(G93A-Veh)。同时,同窝野生型鼠随机分为两组:益生菌复合制剂组(WT-LBE)和赋形剂组(WT-Veh)。药物干预采用灌胃方式,于小鼠60日龄时开始持续到小鼠终末阶段。采用行为学评估,包括体重、rotarod试验、神经学评分观察小鼠表型并确定小鼠发病时间及生存期。并通过免疫荧光、蛋白印迹等方式观察治疗后各组小鼠的肠道病理改变,包括肠道紧密连接蛋白的表达,肠道炎性反应、肠肌间神经元损伤及肠胶质细胞改变、肠神经元中异常SOD1蛋白聚集及促凋亡蛋白表达;以及脊髓病理改变,包括神经元数量、胶质细胞改变、异常SOD1蛋白聚集及促凋亡蛋白表达。随后,通过16s rRNA测序及气相色谱-质谱(Gas chromat ography-mass spectrometry,GC-MS)分析益生菌复合制剂治疗后各组小鼠的肠道菌群及血清短链脂肪酸浓度差异。最后,通过免疫荧光及蛋白印迹方式分析了益生菌复合制剂对脊髓自噬功能的影响以探究其减轻脊髓中异常SOD1蛋白聚集的可能机制。结果:1.我们在90日龄SOD1G93A小鼠中观察到肠道的结构及功能的显著异常,主要包括肠动力异常,肠屏障功能受损、肠道炎症反应增强、肠神经系统中异常SOD1蛋白及促凋亡蛋白累积、肠肌间神经节中神经元数目减少及肠胶质细胞增生,同时在90日龄的SOD1G93A小鼠脊髓中观察到异常SOD1蛋白及促凋亡蛋白积累及神经胶质细胞增生,这些肠道及脊髓的病理改变于120日龄时更加显著,表明这些改变与ALS疾病进展有关。此外,与结肠相比,回肠的某些病理改变相对较轻。2.复合益生菌制剂治疗增加了 SOD1G93A小鼠肠道紧密连接蛋白(Claudin1 及 Occludin)以及白介素 10(Interleukin-10,IL-10)的表达,并下调了肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor α,TNF-α)以及白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达。此外,复合益生菌制剂治疗减少SOD 1G93A小鼠肠道肌间神经节中促凋亡蛋白-活性caspase3的表达和异常S OD1聚集,并增加了肌间神经元数量减轻了肠胶质细胞增生。3.复合益生菌制剂治疗减少了 SOD1G93A小鼠脊髓异常SOD1蛋白的聚集,增加脊髓神经元的数量,减少星形胶质细胞及小胶质细胞增生,并增加了神经支配的神经肌肉接头比例。4.复合益生菌制剂治疗改善了 SOD1G93A小鼠的运动症状并延长了其生存期,表现为:与未经治疗的G93A-Veh小鼠相比,G93A-LBE小鼠在转棒试验中掉落的潜伏期显著延长,步态间隔更长,神经评分更低。此外,G93A-Veh小鼠在疾病进展过程中体重迅速下降,而复合益生菌制剂治疗延缓了体重下降时间。发病及生存分析显示:与赋形剂治疗的小鼠相比,益生菌复合制剂治疗显著延长了 SOD1G93A小鼠的后肢运动障碍发作时间(中位数,98天vs110天;P<0.001)和生存期(中位数,124.5天 vs137.5 天;P<0.001)。5.16s rRNA测序显示G93A-Veh小鼠肠道微生物区系组成与WT-V eh小鼠具有差异,在细菌门水平上,与WT-Veh小鼠相比,SOD1G93A小鼠的厚壁菌门与变形菌门的比率显著降低,这种现象通过益生菌复合制剂治疗逆转。在细菌属水平上,与WT-Veh相比,SOD1G93A小鼠的乳杆菌属、肠杆菌属和Lachnoclostridium属的相对丰度显著降低。复合益生菌制剂治疗显著提高了乳杆菌属和肠杆菌属的相对丰度,并轻度增加了 L achnoclostridium属的相对丰度,此外,复合益生菌制剂治疗显著增加了拟杆菌属和副拟杆菌属的相对丰度,并显著降低了瘤胃球菌科NK4A214属的相对丰度。6.血清短链脂肪酸检测显示与WT-Veh小鼠相比,G93A-Veh小鼠的血清丁酸、异丁酸和己酸浓度降低,而复合益生菌制剂治疗使SOD1G93 A小鼠的血清丁酸、异丁酸和己酸浓度恢复。此外,复合益生菌制剂处理显著增加了血清丙酸的含量。7.免疫荧光染色显示与WT-Veh小鼠相比,G93A-Veh小鼠腰髓中观察到大量的自噬底物p62/SQSTM1(p62)聚集,并与异常SOD1蛋白聚集体存在明显的共定位,表明自噬异常参与了 SOD1G93A小鼠脊髓中异常SOD1蛋白的聚集。而复合益生菌制剂治疗明显减少了这种共定位,提示复合益生菌制剂治疗可能通过改善自噬促进脊髓中异常SOD1蛋白的降解而发挥保护作用。另外,免疫荧光及蛋白印迹显示相对于WT-Veh小鼠,G93A-Veh小鼠脊髓中p62及LC3明显增多,并存在明显的共定位,这表明SOD1G93A小鼠自噬流异常,而导致自噬清除异常蛋白的能力受损。而复合益生菌制剂治疗明显增加了 LC3Ⅱ蛋白水平并减少了p62蛋白水平。小结:在SOD1G93A小鼠中,影响脊髓的病理因素也在肠神经系统中观察到,包括病理性SOD1蛋白聚集、促凋亡蛋白表达增加、炎症细胞激活以及胶质细胞增生,并伴随肠神经元的丢失、肠上皮屏障完整性受损。这些病理改变可能与肠道菌群相关并在ALS病程进展发挥不良作用。口服复合益生菌制剂可以减轻脊髓和肠道的促炎反应,减少肌间神经元和脊髓中异常SOD1聚集,保护肠道及脊髓神经元细胞,改善小鼠运动症状并延长小鼠生存期。复合益生菌制剂的积极作用可能归因于其对肠道菌群的调控及短链脂肪酸水平的增加。在作用机制上,复合益生菌制剂加强SO D1G93A小鼠自噬水平并促进了自噬底物蛋白及异常SOD1蛋白的降解是其发挥疾病改善作用的机制之一。第二部分 短链脂肪酸增强NSC34-hSOD1G93A细胞自噬水平并促进异常SOD1蛋白降解目的:探究短链脂肪酸对NSC34-hSOD1G93A细胞自噬及异常SOD 1蛋白水平的影响并探究作用机制。方法:应用带有GFP标签的hSOD1G93A质粒稳定转染的NSC34细胞,称为NSC34-hSOD1G93A细点击此处胞,作为ALS细胞模型。应用带有G FP标签的空质粒稳定转染的NSC34细胞,称为NSC34-E细胞,作为对照细胞。细胞分组如下:E-对照组、G93A-对照组、G93A-丁酸钠组、G 93A-丙酸钠组、G93A-乙酸钠组、G93A-丁酸钠+丙酸钠组、G93A-丁酸钠+丙酸钠+乙酸钠组。药物干预后通过免疫荧光及蛋白印迹方法检测各组异常SOD1、自噬底物p62及LC3 Ⅱ的蛋白水平,通过免疫荧光及蛋白印迹检测P-mTOR的蛋白水平,通过RT-qPCR检测自噬相关基因ATG-5,ATG-7,Beclin1,LC3B,Lamp2,Rab7的表达。通过活细胞成像技术观察SCFAs对NSC34-hSOD1G93A细胞增殖活力的影响。结果:1.免疫荧光染色及蛋白印迹结果显示与NSC34-E相比NSC34-SOD1 G93A细胞LC3Ⅱ与p62水平的增加,提示自噬功能受限。丁酸钠与丙酸钠给药呈剂量依赖性增加LC3Ⅱ蛋白水平并减少p62蛋白水平,并且两种药物混合给药效果略有提升。然而,乙酸钠给药未见对上述影响,加用乙酸钠至上述两者混合物中也未见明显疗效增高。提示短链脂肪酸中的丁酸钠和丙酸钠治疗提高了自噬水平并促进了自噬流通畅。2.蛋白印迹结果显示短链脂肪酸中的丁酸及丙酸给药呈剂量依赖性减轻细胞内异常SOD1蛋白水平,并且两种药物混合给药效果略有提升。然而,加用乙酸钠至上述两者混合物中也未见明显疗效增高。3.免疫荧光染色及蛋白印farmed Murray cod迹结果显示不同种类的短链脂肪酸均未显著改变P-mTOR表达。提示短链脂肪酸通过非mTOR依赖方式调控ALS运动神经元自噬水平。4.实时定量RT-qPCR检测发现丁酸钠及丙酸钠升高了 ATG-5,ATG-7,Beclin1,LC3B,LAMP2,Rab7基因的表达水平,这些基因参与了自噬小体及溶酶体的生成及自噬体及溶酶体的融合等过程。两种药物混合给药效果略有提升。然而,加用乙酸钠至上述两者混合物中也未见明显疗效增高。5.活细胞成像显示,具有自噬调控及降解异常SOD1蛋白能力的丁酸钠,丙酸钠及两者的混合物均改善了 NSC34-SOD1G93A细胞的活力和增殖。小结:短链脂肪酸中的丁酸钠和丙酸钠均可以调控NSC34-SOD1G93 A细胞自噬水平,改善自噬通量,降低细胞内异常SOD1蛋白聚集并改善细胞增殖活力,并且两种药物混合给药效果略有提升。这两种短链脂肪酸的自噬调控作用是非P-mTOR依赖性的,而与调控多种自噬相关基因的表达有关。第三部分 短链脂肪酸延长SOD1G93A小鼠生存期并保护脊髓神经元细胞目的:观察具有自噬调控作用的短链脂肪酸对SOD1G93A小鼠生存期及脊髓病理的影响。方法:将SOD1G93A小鼠随机分为4组:赋形剂组(G93A-Veh),丁酸钠组(G93A-But),丙酸钠组(G93A-Pro),丁酸钠+丙酸钠组(G93A-But+P ro)。药物采用腹腔注射方式,于小鼠60日龄开始持续到小鼠终末阶段。采用行为学评估,包括rotarod试验、神经学评分观察小鼠表型并确定小鼠发病时间及生存期。通过免疫荧光方式观察治疗后各组小鼠的脊髓病理改变,包括神经元数量、胶质细胞改变、异常SOD1蛋白的聚集,通过免疫荧光、蛋白印迹方式检测脊髓p62及LC3蛋白水平。结果:1.丁酸钠、丙酸钠及其两者的混合物治疗均改善了 SOD1G93A小鼠的运动症状并延长了后肢运动障碍发作时间(中位数111 vs 103 P=0.0273,中位数 114 vs 103 P=0.0025,中位数 118 vs 103 P<0.001)。对各组小鼠生存期分析发现,单独丙酸钠及丁酸钠+丙酸钠治疗治疗延长了生存时间(中位数139 vs 131P=0.024,中位数141 vs 131P=0.0029),单独丁酸钠治疗轻微延长了生存时间(中位数136 vs 131 P=0.087)。2.免疫荧光染色结果显示丁酸钠+丙酸钠的药物组合处理增加了脊髓运动神经元的数量,减少星形胶质细胞及小胶质细胞增生。3.免疫荧光染色结果显示丁酸钠+丙酸钠的药物组合处理减少了 SO D1G93A小鼠脊髓中异常SOD1及p62蛋白聚集及其共定位。免疫荧光染色及蛋白印迹结果显示丁酸钠+丙酸钠的药物组合处理减少了 SOD1G93 A小鼠脊髓中p62蛋白水平,并提高LC3 Ⅱ蛋白水平。小结:丁酸钠、丙酸钠及两者混合物均可延长SOD1G93A小鼠运动功能障碍的发生,其中丙酸钠及丁酸钠+丙酸钠治疗明显延长了 SOD1G93A小鼠生存期。此外,丁酸钠+丙酸钠的混合治疗减少了脊髓中异常SO D1蛋白聚集,并改善了脊髓炎性反应,保护了脊髓神经元细胞。增强SO D1G93A小鼠脊髓自噬水平并促进了异常SOD1蛋白降解是其发挥疾病改善作用的机制之一。