目的:本课题拟通过肾脏基因测序结合网络药理学分析,研究清达颗粒减轻高血压所致肾脏损害的潜在关键成分、靶点和通路;并进一步通过体内外实验,深入阐释清达颗粒防治高血压和对肾脏保护作用的分子机制和物质基础,以期为清达颗粒的临床推广应用提供理论和实验依据。方法:1.清达颗粒防治高血压、减轻肾脏损害的作用效果研究:选择8周龄C57BL/6小鼠,分为Control组、AngⅡ组、AngⅡ+QDG组(n=12),Control组小鼠皮下植入生理盐水渗透泵,并给予生理盐水灌胃;AngⅡ组、AngⅡ+QDG组皮下植入AngⅡ渗透泵(500ng/kg/min)造模4周,分别给予生理盐水和清达颗粒灌胃;采用无创鼠尾动脉血压检测仪观察清达颗粒对血压的干预效果;通过HE染色观察小鼠肾脏组织的形态及病理改变;TUNEL染色观察小鼠肾脏组织的细胞凋亡情况;Masson染色观察小鼠肾脏组织纤维化的程度。2.基于网络药理学及肾脏基因测序探讨清达颗粒减轻高血压肾脏损害的潜在关键靶点和通路:采用网络药理学的方法,综合运用多个数据库,分析构建清达颗粒治疗高血压的药物成分-作用靶点-目标基因-信号通路的多层次作用网络;采用RNA测序检测清达颗粒干预高血压肾脏组织中差异基因表达;然后将测序结果与清达颗粒的网络药理学研究结果取交集,通过GO富集分析和KEGG富集分析对两者的共同基因进行分析,寻找清达颗粒的潜在核心靶点和关键信号通路,解析清达颗粒防治高血压肾损害的作用机制。3.验证清达颗粒防治高血压肾损害Cobimetinib试剂的核心靶点和关键途径:1)体内实验:比色法检测小鼠肾脏组织中MDA和SOD含量;Western-Blot检测小鼠肾脏组织中NOX1的表达;q-PCR检测肾脏组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的m RNA水平;ELISA法检测肾脏组织中ROS、TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白水平;免疫组化法检测小鼠肾脏组织中NF-k B信号通路相关蛋白的表达;Western-blot检测小鼠肾脏组织中凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2和p53的表达。2)体外实验:通过AngⅡ刺激NRK-52E肾小管上皮细胞,构建高血压肾损伤的细胞模型;采用CCK8检测不同浓度清达颗粒对NRK-52E细胞活力的影响;ROS探针法检测NRK-52E细胞中ROS的水平;比色法检测NRK-52E细胞中MDA和SOD含量;q-PCR检测NRK-52E细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的m RNA水平;ELISA法检测NRK-52E细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌水平;TUNEL染色和Annexin V/PI染色观察NRK-52E细胞的凋亡;Western-blot检测NRK-52E细胞中NOX1蛋白、凋亡相关蛋白、NF-k B信号通路相关蛋白和p53蛋白的表达。结果:1.清达颗粒可抑制AngⅡ诱导的高血压小鼠的血压升高,并可减轻肾脏损伤1)与Control组相比,AngⅡ组小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压显著升高(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压显著降低(P<0.05);各组间小鼠的体重无明显差异(P>0.05);2)与Control组相比,AngⅡ组小鼠的肾小球萎缩、基底膜增厚,肾小管排列紊乱,肾间质内炎症细胞浸润增多,肾脏指数显著增加(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠的肾脏病理形态显著改善,肾脏指数显著减少(P<0.05);3)与Control组相比,AngⅡ组小鼠的肾脏纤维化和胶原容积分数显著增加(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠的肾脏纤维化和胶原容积分数显著减少(P<0.05);4)与Control组相比,AngⅡ组小鼠的肾脏细胞凋亡明显增多(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠的肾脏细胞凋亡明显减少(P<0.05)。2.肾脏组织RNA测序和网络药理学相结合探讨清达颗粒改善高血压肾损害的潜在关键成分、靶点和信号通路1)网络药理学分析结果显示,槲皮素、黄芩苷、木犀草素等是清达颗粒治疗高血压的关键活性成分;2)肾脏RNA测序结果提示,AngⅡ组小鼠肾脏组织中有1427个基因表达上调,1173个基因表达下调,清达颗粒干预后,可逆转261个下调的基因和401个上调的基因;3)GO富集分析和KEGG富集分析发现,包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡的多个生物过程和包括NF-k B信号通路和p53信号通路等多条信号通路被富集。3.清达颗粒对肾脏氧化应激、炎症反应和细胞凋亡的调控作用(1)清达颗粒减轻高血压肾损伤中的氧化应激反应:体内实验结果显示,与Control组相比,AngⅡ组小鼠肾脏组织中的NOX1蛋白表达、MDA水平和ROS水平均明显上调(P<0.05),SOD水平明显下调(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠肾脏组织中的NOX1蛋白表达、MDA水平和ROS水平均明显下调(P<0.05),SOD水平明显上调(P<0.05)。体外实验结果显示,与CNeurobiological alterationsontrol组相比,AngⅡ组NRK-52E细胞中的NOX1蛋白表达、MDA水平和ROS水平均明显上调(P<0.05),SOD水平明显下调(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组NRK-52E细胞中的NOX1蛋白表达、MDA水平和ROS水平均明显下调(P<0.05),SOD水平明显上调(P<0.05)。(2)清达颗粒抑制高血压肾脏炎症反应:体内实验结果显示,与Control组相比,AngⅡ组小鼠肾脏组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的m RNA水平和蛋白水平均明显升高(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠肾脏组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的m RNA水平和蛋白水平均明显降低(P<0.05)。体外实验结果显示,与Control组相比,AngⅡ组NRK-52E细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的m RNA水平均明显升高(P<0.05),上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌水平也明显升高(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组NRK-52E细胞中IL-6、TNF-α和IL-1β的m RNA水平明显降低(P<0.05),上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌水平也明显降低(P<0.05)。(3)清达颗粒抑制高血压肾脏炎症反应信号通路NF-k B的激活:体内实验结果显示,与Control组相比,AngⅡ组小鼠肾脏组织中p65,p-P65,p-Ik B的表达明显增加(P<0.05),Ik B的表达明显减少(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠肾脏组织中p65,p-P65,p-Ik B的表达明显减少(P<0.05),Ik B的表达明显增加(P<0.05)。体外实验结果显示,与Control组相比,AngⅡ组NRK-52E细胞中p65,p-P65,p-Ik B的表达明显增加(P<0.05),Ik B的表达明显减少(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组NRK-52E细胞中p65,p-P65,p-Ik B的表达明显减少(P<0.05),Ik B的表达明显增加(P<0.05)。(4)清达颗粒显著减轻高血压导致的肾脏细胞凋亡:体内实验结果显示,与Control组相比,AngⅡ组小鼠肾脏组织中细胞凋亡数量明显增加(P<0.05),P53、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达明显上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达明显下调(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组小鼠肾脏组织中细胞凋亡数量明显减少(P<0.05),P53、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达明显下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达明显上调(P<0.05)。体外实验结果显示,与Control组相比,AngⅡ组NRK-52E细胞的凋亡数量明显增加(P<0.05),P53、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达明显上调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达明显下调(P<0.05);与AngⅡ组相比,AngⅡ+QDG组NRK-52E细胞selleck的凋亡数量明显减少(P<0.05),P53、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的蛋白表达明显下调(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论:清达颗粒不仅能抑制AngⅡ诱导的高血压小鼠的血压升高,还能改善AngⅡ诱导的高血压小鼠的肾脏病理形态,抑制肾脏纤维化。清达颗粒可能通过调控NF-k B和P53信号通路抑制肾脏组织中的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡,发挥其降压及肾脏保护作用。