聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHAs)是一种有利于环境的聚合物,它与传统的合成塑料的物化特性类似,因此在很多应用领域都被广泛关注。菌株Pseudomonas sp.SG4502中的PhaC是一种用来合成PHA的聚合酶,由于它的底物特异性十分广泛,通过对PhaC1氨基酸Ser324Thr/Gln480Lys突变导致突变体[PhaC1_(SG(STQK))]对乳酸(LA)底物有活性,可以高效合成聚(乳酸-co-3-羟基丁酸)P(LA-co-3HB)。通过突变PhaC活性中心附近的氨基酸可以改变酶的活性和底物特异性,促进新型的PHAs合成研究更多。本研究将Ⅰ型聚合酶PhaC_(Re)的3D结构与Ⅱ型聚合酶PhaC1_(Ps(STQK))的氨基酸序列进行同源建模,其中已知I型聚合酶的3D结构是来自菌株Cupriavidus necator H16,II型酶的氨基酸序列则来自菌株Pseudomonas sp.SG4502。在PhaC1_(Ps(STQK))基础上,根据可能引起酶活性中心改变的氨基酸设计突变体并利用KOD-Plus-Mutagenesis Kit方法构建七种突变体。然后对构建的七种突变体酶通过原核表达系统进行表达并提纯,利用七种不同的底物分析聚合酶突变体的活性和底物特异性。首先,利用SWISS-MODEL建模软件将Ⅱ型PHA聚合酶PhaC1_(Ps(STQK))的氨基酸序列放入其中与已报道的PhaC_(Re)3D模型进行同源建模。根据已报道的I型中可以与底物(R)-3HB相结合的氨基酸F117位可能通过改变通道的大小从而可能影响其活性,而在II型中此位点被存在于活性中心(Cys117,Asp272,His300)附近的氨基酸A116位所替代,同时因为A116位与F52位在空间上对应且相互影响,也位于活性中心附近,所以推测有可能这些位点的occult hepatitis B infection突变会影响酶的活性和底物特异性。根据以上分析,将在PhaC1_(Ps(STQK))突变后进一步对F52,A116位的氨基酸进行单点F52I/M/H和双点F52I/M/HA116L突变。然后,将携带pha C1_(Ps(STQK))基因且来自菌株Pseudomonas sp.SG4502的重组质粒进行构建并使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit将其作为模板,把设计的单点和双点突变(F52I/M/H,F52I/M/HA116L)的重组质粒进行构建。在大肠杆菌BL21(DE3)中将得到的重组质粒转入并筛选得到七种工程菌株:野生型工程菌株BL21-p QE-80L-pha C1_(Ps(STQK))、三种单点突变工程菌株BL21-p QE-80L-pha C1_(Ps(STQK)F52I/M/H)、三种双点突变工程菌株BL21-p QE-80L-pha C1Ps(STQK)F52I/M/HA116L。最后,利用原核表达系统对PhaC1_(Ps(STQK))及六种突变工程菌株进行体外大量表达并利用His-tag亲和层析柱将蛋白分离纯化得到目的蛋白。PhaC1_(Ps(STQK))的浓度为1.7 mg/m L,单点和双点突变体的浓度分别为:4.3 mg/m L、4.5 mg/m L、2.4 mg/m L、3.0 mg/m L、4.4 mg/m L、3.1 mg/m L,单点和双点突变后蛋白的表达量均有不同程度的提高。使用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)法测定的突变体的活性结果如下,单点突变体PhaC1_(Ps(STQK)F52M)对(R)-2HB、D-LA两种底物来说,相比Fulvestrant价格PhaC1_(Ps(STQK))的比活力有显著升高。双点突变体PhaC1_(Ps(STQK)F52HA116L)对底物(R)-3HB、(R)-2HB、3HP、D-LA、(R/S)-2HV的比活力相比PhaC1_(Ps(STQK))均有大幅度的提高,表明F52HA116L的双点突变为有益突变,也可以影响多种底物的聚合活性。而当以(R)-MA、4HBZ为底物时,突变后酶的比活力变化均不明显。