背景:全球超过一半的人都感染或曾经感染过幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori),这与口-口传播及粪-口传播方式有着密切的联系。幽门螺杆菌的感染与多种疾病相关,如消化性溃疡、胃癌。然而,随着抗生素的滥用,人们发现幽门螺杆菌对主要抗生素的耐药性迅速发展,给临床治疗带来了巨大的挑战。研究发现,幽门螺杆菌的致病性与细胞毒素相关蛋白A基因(cytotoxin-associated gene A,cag A)和空泡毒素(vacuolating cytotoxin A,vac A)毒力基因密切相关,对于cag A、vac A阴性且无任何临床症状的PF-03084014分子式人群,可不必盲目选择根除治疗。因此,幽门螺旋杆菌的快速诊断及毒力基因的分型对于指导临床治疗及控制传播有着极为重要的作用。目的:运用基因编辑技术(CRISPR-Cas12a)结合重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),为临床幽门螺杆菌的检测及毒力基因分型提供新的技术手段。方法:培养幽门螺杆菌标准菌株ATCC700392,验证培养菌落并提取核酸。针对幽门螺杆菌特异性基因16S r DNA基因以及毒力基因cag A、vac A基因,使用引物设计软件Primer Premier 5.0设计RPA引物,然后将RPA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据条带亮度筛选引物,并对产物进行测序。将模板DNA按一定倍数稀释,用于RPA和PCR扩增,然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳TEMPO-mediated oxidation,观察两种扩增方法检测限。成功筛选RPA引物后,对扩增产物片段的PAM位点后20-24bp处设计合成cr RNA,用于Cas12a蛋白切割FAM-BHQ1双标记单链DNA探针实验,并根据荧光定量PCR仪的曲线起峰高低筛选cr RNA。然后用免疫层析试纸条验证上述筛选的RPA引物和cr RNA,并测试检测限。最后,对包括唾液、胃液、粪便在内的共87份标本进行临床验证及方法学评价。结果:(1)成功培养出幽门螺旋杆菌并进行核酸提取,OD260/OD280比值达到1.8-2.0。(2)成功设计并筛选出针对3个基因的3组RPA引物。RPA与PCR琼脂糖凝胶电泳检测限均达到1ng/μL。(3)成功设计并筛选出分别针对3个RPA扩增产物的3条cr RNA。(4)建立起RPA-Cas12a-侧流免疫层析试纸条检测方法,整个反应过程只需要25分钟,且灵敏度可达到2ng/μL。(5)唾液检测结果与临床尿素呼气实验一致,胃液检测结果与PCR检测结果一致,粪便检测结果与临床血清学抗体检测一致。结论:本研究基于CRISPR-Cas12a技术,建立起RPA-Cas12a-侧流免疫层析试纸条检AZD1152-HQPA研究购买测新方法,并完成了临床标本验证,这为临床检测幽门螺杆菌及毒力基因提供了新的技术手段。该方法操作简便,且价格低廉,不受场地限制,可以应用于各种场景,包括基层医院,社区诊所以及户外。