MicroRNA(miRNA)是一类长度为21–25个核苷酸的小型、进化保守的非编码RNA分子家族,可在转录后调控中发挥重要作用。作为一类新型的生物标志物,miRNA与癌症等疾病的发生与发展有着紧密的联系,例如miR-21在多种癌症中均能发现异常表达。因此实现细胞内miRNA的灵敏检测与成像分析对癌症的早期诊断具有重要意义。然而在实际检测中,由于miRNA表达丰度较低、序列较短,现有的miRNA检测方法仍存在反应时间较长,易受复杂生物环境的干扰等问题,导致如何在细胞水平上进行miRNA的快速、高灵敏检测与成像分析仍是一个巨大的挑战。随着DNA纳米技术的蓬勃发展,DNA组装体因其较好的可编程性、尺寸可控性和生物相容性被广泛应用于生物传感和成像领域。在其构建方面,许多研究通过DMirdametinib研究购买NA扩增技术组装形成具有不同功能的DNA组装体。其中,滚环扩增技术(Rolling circle amplification,RCA)作为一类等温酶促核酸扩增技术,其能够在短时间内产生大量具有重复序列的DNA单链,同时可以采用DNA杂交反应实现对不同DNA功能基团的高效负载,具有高灵敏度和多功能性等优点,在分子识别、生物成像等领域具有较大的应用潜力。本文基于RCA技术构建了具有可编程性与双重信号放大功能的DNA酶(DNAzyme)组装体,并将其成功应用于miRNA的快速、灵敏检测与成像分析,主要包括以下两个方面:1.基于RCA构建的可编程DNAzyme组装体用于miR-21的快速检测与成像分析在RCA产物上精确负载DNAzyme和底物链(Substrate),形成具有较好生物相容性的线性可编程DNAzyme组装体。通过对环状模板(Circular template,CT)序列的可编程设计,DNA组装体能够调控DNAzyme与底物链的相对位置以实现最快的反应速率与最佳的信号响应。当miR-21存在时,DNAzyme能够在Na~+辅助下对底物链进行循环切割实现对细胞内miR-21的快速检测与成像分析。长链DNA载体所产生的“限域效应”能够明显提高反应物的局域浓度从而加快反应速率。溶液中的实验结果表明,当miR-21的浓度在0.100–40.0 nmol/L时,信背比(F/F_0)与miR-21的浓度呈现出良好的线性关系,检测限为21.7 pmol/L。细胞成像的实验结果表明由于DNA长链的保护作用,使得该组装体具有较好的生物稳定性,同时相较于游离DNAzyme组具有更强的荧光信号。细胞内的荧光强度随着miR-21含量的上调与下调发生相应变化,表明探针能够在细胞内实现对miR-21的特异性响应和动态含量监测,同时可以成功用于正常细胞和癌细胞的鉴别。本工作对于推进RCA技术在生物传感和细胞成像领域的应用具有重要意义。2.基于RCA构建的自反馈双重信号放大器用于miR-21的高灵敏检测与成像分析利用RCA产物负载DNAzyme和带有miR-2Timed Up-and-Go1类似物的底物链,形成具有双重信号放大功能的DNA组装体。当miR-21存在时,DNAzyme能够在Mg~(2+)的驱动下对底物链进行切割进行第一重信号放大。随后不断产生的游离miR-21类似物能够持续参与反应实现自反馈信号刺激响应,形成由DNAzyme和自反馈信号刺激响应介导的双重信号放大模式,用于细胞内miRNA的高灵敏检测与成像分析。实验结果表明,当miR-21的浓度在50.0 pmol/L–30.0 nmol/L时,F/F_0与miR-21的浓度呈现出良好的线性关系,检测限为6.70 pmol/L。相较于没有自反馈机制的DNAzyme信号放大反应过程,该信号双重放大器的灵敏度提升了约4.2倍,检测限降低了约115倍。细Empagliflozin纯度胞成像结果显示该探针对细胞内miR-21具有较强的选择性,荧光强度随着细胞内miR-21的含量变化而随之改变。同时其在细胞内的荧光信号明显强于无自反馈信号刺激响应的DNAzyme探针与游离的DNAzyme,表明该探针在细胞内具有较强的信号放大能力与生物稳定性,能有效提升一维DNA组装体的灵敏度与检测范围。综上所述,本文采用RCA技术构建两种DNA组装体用于细胞内miRNA的成像分析。基于RCA构建可编程DNAzyme组装体,通过调控DNAzyme和底物链的相对位置显著提升组装体的反应速率,并成功应用于细胞内miRNA的快速检测与成像分析。通过RCA构建带有双重信号放大功能的DNA组装体,较好地提升了一维DNA纳米探针的灵敏度与检测能力,同时实现对miRNA的高灵敏检测以及肿瘤细胞的成像分析。以上方法成功拓宽了RCA技术在DNA组装体的构建以及miRNA成像分析中的应用,在癌症的早期筛查与预防等方面展示出了巨大的应用前景。