1.研究背景及目的以多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)为代表的退行性疾病是发生于中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的一种由脱髓鞘诱发的神经变性疾病。目前针对这种神经变性,其中一种干预策略就是通过增强神经干细胞分化为可髓鞘化的少突胶质细胞。在此过程中,中枢神经系统中的免疫细胞—小胶质细胞对神经干细胞定向分化为少突胶质细胞的过程具有重要的作用。具体来说,小胶质细胞介导的炎症微环境影响着神经干细胞分化的命运。在不同疾病状态下,小胶质细胞可表现为促炎表型M1型和抗炎表型M2型。M1型小胶质细胞释放的促炎因子具有组织损伤的作用,在此条件下神经干细胞多分化为形成瘢痕的星形胶质细胞。M2型小胶质细胞介导的炎症消散因子有利于神经干细胞分化为神经元或少突胶质细胞,其中M2型小胶质细胞释放的Chi313、TGF-β等可促进神经干细胞定向分化为少突胶质细胞。因此,通过调节小胶质细胞介导的微环境从而增强内源性少突胶质细胞生成过程来促进髓鞘再生,已成为延缓、阻止或逆转MS进展的最有希望的措施之一。目前,大量的临床和实验研究也已经在促进神经干/祖细胞分化为少突胶质细胞从而促进髓鞘再生方面取得了积极的成果。鉴于小胶质细胞与神经干细胞及其子代的密切联系,特别是它们可以分泌的无数分子影响了干细胞的分化命运,因此,可以认为小胶质细胞是调节神经干细胞定向分化为少突胶质细胞从而实现髓鞘再生的一种重要的细胞。在之前的研究中我们对双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)促进髓鞘再生的有效性进行了研究,显示小胶质细胞可能是DHA发挥作用的重要效应细胞,但DHA是否依赖小胶质细胞发挥髓鞘再生的药效尚不清楚。并且在前期研究中发现在DHA可促进EAE和CPZ诱导的模型小鼠胼胝体区域少突胶质细胞系新生的作用,提示DHA可能具有在源头上促进少突胶质细胞生成的作用。鉴于促进神经干细胞定向分化是少突胶质细胞系生成的源头动力,我们提出假说:DHA依赖小胶质细胞促进神经干细胞分化发挥促进髓鞘再生的作用,从而促进脱髓鞘导致的神经退行性疾病患者的白质修复。基于上述分析,我们通过建立“小胶质细胞-神经干细胞”单元,建立消融小胶质细胞的EAE模型小鼠,在给药DHA后,研究DHA是否通过“小胶质细胞-神经干细胞”单元促进髓鞘再生,发挥治疗EAE的药效。另外,对DHA是如何通过“小胶质细胞-神经干细胞”单元发挥促进髓鞘再生的机制进行探索。首先对DHA促进小胶质细胞作用于神经干细胞的桥梁分子进行探索,并进一步深入探索DHA是如何促进小胶质细胞表达此桥梁分子,其分子通路为何,并通过实验反向验证DHA发挥药效和此通路的依赖关系。2.研究方法及内容2.1DHA通过小胶质细胞重塑炎症微环境的药理作用研究(1)利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)100ng/mL刺激小胶质细胞4h模拟小胶质介导的炎症失衡微环境,DHA给药24h,设置低、中、高三个剂量,分别为1μM、2μM、4μM。收集上清液用于ELISA实验,Trizol裂解细胞5分钟用于qRT-PCR实验,于-20℃保存。流式细胞术与免疫荧光收样品及时处理检测。利用qRT-PCR和ELISA实验方法检测小胶质细胞介导的促炎因子IL-1 β、TNF-α和抗炎因子IL-10 mRNA和分泌蛋白的表达情况;利用流式细胞术检测促炎小胶质细胞的比例;利用免疫荧光方法对小胶质细胞的极化情况进行检测;评价DHA对基于小胶质细胞的炎症微环境重塑的影响。(2)利用 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库查询双氢青蒿素的结构及Canonical SMILES,将Canonical SMILES分别导入SwissTargetPrediction(http://swisstargetprediction.ch/)、SEA(https://sea.bkslab.org/)预测靶点。利用 GeneCards(https://www.genecards.org/)和 OMIM(https://omim.org/)数据库中得到疾病靶点,通过整合,去除重复值,得到疾病靶点。使用Cytoscape3.8.2软件构建“药物-作用靶点”网络。将药物-交集基因上传至相互作用数据库String(https://string-db.org/)进行蛋白相互作用网络构建(PPI)数据库;将药 物-疾病交集基 因 上传 至 DAVID 数据 库(https://david.ncifcrf.gov/summary.j sp),基 因 标 识 符 选 择OFFICIAL_GENE_SYMBOL,物种设置为:Homo Sapiens。为阐明双氢青蒿素治疗神经炎症的靶点在信号通路中进行KEGG通路富集分析。选取GO功能条目和KEGG通路条目(P<0.05)作为双氢青蒿素治疗神经炎症的主要基因功能富集过程和信号pain biophysics通路,预测双氢青蒿素治疗神经炎症的作用机制。(3)利用Western Blot的技术对网络药理学预测的关键通路中关键基因Axl、p-Axl(Y702)、PI3K、p-PI3K(Tyr317)、Akt、p-Akt(Ser473)、mTOR、p-mTOR(S2448)表达情况进行实验验证。2.2DHA通过小胶质细胞促进EAE模型髓鞘再生的药效评价(1)利用MOG35-55诱导EAE的模型,造模当天及第二天,对小鼠进行腹腔注射0.5PTX(500ng/只)。在免疫后第8天小鼠逐渐开始发病,给予EAE模型小鼠含有0.029%PLX3397(一种能够穿过血脑屏障口服的选择性CSF1R/c-kit的抑制剂)的小鼠维持饲料,以对其小胶质细胞进行消融;喂养PLX3397饲料10天后给药DHA,共给药10天。自造模第1天开始对小鼠进行体重和状态的检测,以体重和临床KONOS评分作为药效指标,在28天取材,取胸腺、脾称重;眼眶取血离心取血清-20℃保存;小鼠脑组织、腰髓组织浸泡于多聚甲醛中。(2)利用免疫组化的方法对小鼠脑组织1/3处纵截面中小胶质细胞分子标记物CD11b进行染色,以验证小胶质细胞的消融情况。(3)利用固蓝染色的方法对小鼠脑组织1/3处纵截面进行染色,观察小鼠脑组织髓鞘化程度,研究DHA是否通过小胶质细胞发挥维持髓鞘完整性、促进髓鞘再生的作用。2.3DHA通过小胶质细胞促进神经干细胞分化的活性评价(1)建立小胶质细胞-神经干细胞过继培养体系,DHA给药小胶质细胞后培养24h,弃去含药上清,加入新鲜培养基继续培养24h,将上清过继给予神经干细胞C17.2细胞中培养24h,RIPA和Trizol裂解蛋白和收集核酸,-20℃保存。(2)利用qRT-PCR和Western Blot的方法对神经干细胞分子标记物-Nestin、星形胶质细胞分子标记物-胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Portein,GFAP)、神经元分子标记物-神经元核抗原(Neuronal Nuclei,NeuN)、少突胶质细胞系分子标记物-髓鞘蛋白脂质蛋白(Myelin Proteolipid Protein,PLP)、成熟少突胶质细胞分子标记物-髓鞘碱性蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)mRNA和蛋白进行检测,评价DHA通过小胶质细胞对神经干细胞分化的影响。取EAE小鼠侧脑室下区(Subependymal Ventricular Zone,SVZ)区域,利用免疫组化的方法分别对少突胶质祖细胞分子标记物NG2和成熟少突胶质细胞分子标记物MBP进行染色,评价DHA对神经干细胞分化为少突胶质细胞的影响。(3)利用qRT-RCR方法对小胶质细胞中miR-34a与Chi313 mRNA表达情况进行检测,利用ELISA方法检测分泌蛋白Chi313含量。以评价DHA髓鞘再生的药理作用是否与miR-34a与Chi313表达有关。2.4DHA通过“小胶质细胞-神经干细胞”单元促进髓鞘再生的机制探索(1)利用AS1517499抑制小胶质细胞STAT6的激活,在小胶质细胞中加入浓度为 100 nM 的 AS1517499,处理 24h;给药 DHA 培养 24h;LPS100 ng/mL刺激4h。处理后将贴壁的小胶质细胞利用Trizol裂解,利用qRT-PCR方法检测小胶质细胞中Chi313 mRNA表达情况,同时收集上清液对Chi313蛋白进行ELISA检测。2.3中过继方法处理神经干细胞,利用Western Blot和qRT-PCR的方法对神经干细胞EGFR激活情况以及SOX10、PLP、MBP蛋白及mRNA表达情况进行检测,验证DHA依赖于STAT6促进Chi313表达的作用,以及对神经干细胞定向少突胶质细胞通路中关键分子信号的影响。(2)利用Axl shRNA干扰小胶质细胞Axl转录,给药DHA后,利用qRT-PCR和ELISA方法检测小胶质细胞中Chi313 mRNA与蛋白的表达情况,利用Western Blot和qRT-PCR的方法对神经干细胞EGFR激活情况和SOX10、PLP、MBP蛋白及mRNA表达情况进行检测,验证DHA依赖于Axl促进Chi313表达的作用,以及对神经干细胞定向少突胶质细胞通路中关键分子信号的影响。3.研究结果3.1 DHA通过小胶质细胞重塑炎症微环境的药理作用研究1.LPS刺激小胶质细胞介导的微环境失衡其特点为大量促炎因子过表达同时炎症消散因子表达不足,因此在本节研究中我们利用LPS造模,从而模拟小胶质细胞介导的促炎微环境。实验结果显示,LPS可明显激活静息状态下的小胶质细胞,使小胶质细胞促炎因子IL-1 β、TNF-α显著增高(P<0.05),CD16/32占比显著增加(P<0.05),并显著增强iNOS的荧光强度(P<0.05)。给药DHA后,DHA可显著降低LPhttps://www.selleck.cn/products/vx-661.htmlS刺激后的小胶质细胞介导的促炎分子IL-1 β、TNF-α升高的情况(P<0.05),同时升高炎症消散因子IL-10的表达(P<0.05);流式细胞术结果表示,DHA给药后相比于模型组可显著降低CD16/32标记的M1小胶质细胞占比(P<0.05),免疫荧光结果显示DHA处理过的小胶质细胞相较于模型组标记为Arg1荧光强度增加(P<0.05),iNOS荧光强度减弱(P<0.05)。可以看出DHA可以重塑LPS介导的小胶质细胞炎症微环境,并促进小胶质细胞M1型向M2型转化。2.将神经炎症的靶点与DHA靶点相互映射,共获得药物-疾病交集基因27个;取药物-疾病交集基因,利用DAVID数据库进行GO基因功能富集分析,共筛选出275条GO条目,其中生物过程相关的有285条,细胞成分51条,分子功能39条。综合分析提示:除Axl外,PI3K也是DHA调控的关键靶点之一,而Axl/PI3K/Akt/mTOStaurosporineR通路可能是DHA重塑炎症微环境的重要通路之一。3.PI3K/Akt/m-TOR作为Axl调控的重要通路之一,其激活对促进小胶质细胞M2表型,降低促炎分子的释放有重要的作用。我们对DHA共培养后的小胶质细胞中Axl/PI3K/Akt/mTOR通路的调控情况进行实验验证.Western Blot实验结果表示,DHA给药后的小胶质细胞相较于模型组Axl、p-Axl(Y702)、p-PI3K(Tyr317)、p-Akt(Ser473)、p-mTOR(S2448)蛋白表达增高,PI3K、Akt、mTOR总蛋白表达无明显差异。表示DHA对LPS刺激下的小胶质细胞Axl/PI3K/Akt/m-TOR通路的功能具有激活作用。小结:DHA可重塑LPS介导的小胶质细胞炎症微环境,为髓鞘再生提供了条件和基础,激活Axl/PI3K/Akt/mTOR通路可能是DHA对MS有效性的的内在机制之一。3.2DHA通过小胶质细胞促进EAE模型髓鞘再生的药效评价1.免疫组化结果显示,给予含0.029%的PLX3397饲料喂养的EAE小鼠较正常饲料喂养小鼠的大脑中小胶质细胞分子标记物CD11b阳性占比明显降低,其中给予含0.029%的PLX3397饲料喂养10天后小鼠SVZ区域CD1 1b阳性占比3.93±1.11,正常饲料喂养的小鼠SVZ区域CD11b阳性占比22.64±2.61(P<0.05),说明该实验方法成功实现了对EAE小鼠的小胶质细胞的消融。灌胃给予DHA后,EAE+DHA组小鼠相比于EAE组小鼠临床KONO'S评分明显降低(P<0.01),体重明显增加(P<0.01);喂养含PLX3397饲料后,EAE+PLX3397+DHA相比于EAE+PLX3397组评分及体重无明显差异(P>0.05)。说明DHA缓解EAE模型的残疾程度及维持其体重依赖于小胶质细胞的存在。2.利用劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue,LFB)对小鼠脑组织进行染色,以Imag J进行计算,结果发现,EAE+DHA组LFB阳性面积8.12±1.10相较于EAE组0.66±0.63髓鞘化明显增加(P<0.05);喂养含PLX3397饲料后,EAE+PLX3397+DHA 组 LFB 阳性面积 0.92±0.48 相比于 EAE+PLX3397 组1.16±0.27没有明显差异(P>0.05),说明DHA可依赖于小胶质细胞促进EAE模型小鼠脑内髓鞘再生,维护髓鞘的完整性。小结:DHA发挥治疗EAE、缓解EAE残疾程度、促进EAE髓鞘再生及其完整性的作用,小胶质细胞是其重要条件和基础。3.3DHA依赖于小胶质细胞促进神经干细胞分化的活性评价1.在小胶质细胞上清过继培养神经干细胞试验的结果表明,DHA处理的小胶质细胞上清显著增加了神经干细胞C17.2中少突胶质细胞标记物PLP和MBP mRNA的转录和蛋白的表达(P<0.05),神经干细胞分子标记物Nestin表达的明显降低(P<0.05);但对星形胶质细胞分子标记物GFAP和神经元细胞分子标记物NeuN mRNA无明显影响(P>0.05)。说明DHA可能通过小胶质细胞促进了神经干细胞向少突胶质细胞的定向分化。2.在体外证明了 DHA可通过小胶质细胞促进神经干细胞分化为少突胶质细胞后,我们在体内对侧脑室下区(Subependymal Ventricular Zone,SVZ)少突胶质细胞祖细胞(标记为NG2)与成熟的少突胶质细胞(标记为MBP)进行了免疫组化分析。结果表示,喂养正常饲料EAE小鼠给药DHA后,较EAE组少突胶质祖细胞分子标记物NG2、少突胶质细胞分子标记物MBP阳性信号明显增强(P<0.05),利用PLX3397饲料喂养EAE小鼠消融了小胶质细胞后,DHA促进小鼠SVZ区域的NG2和MBP阳性信号增强的现象消失(P>0.05)。说明,DHA在EAE小鼠体内促进神经干细胞分化为少突胶质细胞的作用同样依赖于小胶质细胞。3.同时,DHA在体外可以抑制小胶质细胞中miR-34a的表达,促进小胶质细胞中Chi313 mRNA和Chi313蛋白的表达(P<0.05)。小结:DHA可通过小胶质细胞促进神经干细胞分化为少突胶质细胞从而促进髓鞘再生,其活性可能与影响了小胶质细胞miR-34a、Chi313的表达有关。3.4DHA通过“小胶质细胞-神经干细胞”单元促进髓鞘再生的机制探索1.在3.3中我们证明了 DHA具有明确的促进Chi313表达作用,而Chi313在神经干细胞分化为少突胶质细胞的过程中起着关键的核心作用,因此,在此部分中我们利用“小胶质细胞-神经干细胞”单元,围绕Chi313表达,基于对在神经干细胞中Chi313-EGFR-SOX10级联关系、对小胶质细胞中Axl/JAK2/STAT6/Chi313通路上的关键因子变化的分析,从正反两个角度深入探讨了 DHA促进髓鞘再生的机制。首先我们通过建立的“小胶质细胞-神经干细胞”单元,对神经干细胞表面受体p-EGFR(Y1068)、SOX10的蛋白表达情况进行研究。结果发现DHA处理过的小胶质细胞上清液过继于神经干细胞中24h后,可使神经干细胞p-EGFR(Y1068)、SOX10表达明显增强(P<0.05)。表示DHA可通过小胶质细胞激活神经干细胞表面受体EGFR,并促进神经干细胞中SOX10的表达。接下来我们对DHA处理过的小胶质细胞中Axl/JAK2/STAT6进行正向验证,结果发现DHA处理过的小胶质细胞相比于模型组p-JAK2(Y1007)、p-STAT6(Y641)表达增强(P<0.05)。JAK2、STAT6总蛋白表达无明显差异(P>0.05),(Axl的结果在第一部分已展示)结果正向验证了 DHA具有激活小胶质细胞中Axl/JAK2/STAT6通路,使小胶质细胞释放Chi313,从而激活神经干细胞EGFR-SOX10,促进神经干细胞分化为少突胶质细胞。2.在正向验证DHA具有激活小胶质细胞Axl/JAK2/STAT6通路的作用后,我们将反向验证DHA是否依赖于小胶质中Axl/JAK2/STAT6/Chi313通路发挥激活神经干细胞EGFR-SOX10,促进神经干细胞分化为少突胶质细胞的作用。研究结果表示,利用AS1517499抑制小胶质细胞中STAT6激活后,DHA丧失促进小胶质细胞表达Chi313 mRNA和蛋白的作用,同时其上清液过继于神经干细胞后,p-EGFR(Y1068)蛋白无明显变化,SOX10、PLP、MBP mRNA和总蛋白无明显变化。表示DHA依赖于STAT6的激活发挥分泌Chi313和促进神经干细胞分化为少突胶质细胞的作用。3.进一步地,我们将使用sh-RNA干扰Axl mRNA的转录,进而验证DHA是否对小胶质细胞中Axl/JAK2/STAT6通路有依赖关系。结果表示利用携带Axl shRNA的慢病毒转染小胶质细胞后,DHA丧失促进小胶质细胞表达Chi313m RNA和蛋白的作用,同时其上清液过继于神经干细胞后,p-EGFR(Y1068)蛋白无明显变化,SOX10、PLP、MBP mRNA和总蛋白无明显变化。表示DHA依赖于Axl发挥分泌Chi313和促进神经干细胞分化为少突胶质细胞的作用。小结:DHA通过激活小胶质细胞中Axl/JAK2/STAT6通路促进Chi313的释放,从而激活神经干细胞EGFR受体,促进SOX10表达,进而发挥促进神经干细胞向少突胶质细胞方向分化的作用。4.结论(1)DHA可明显缓解EAE模型小鼠的残疾程度。(2)DHA可重塑小胶质细胞介导的炎症微环境,为髓鞘再生提供了条件。(3)DHA对EAE模型小鼠髓鞘再生作用的发挥依赖于中枢神经系统中存在的小胶质细胞。(4)DHA促进EAE模型小鼠髓鞘再生的作用主要是通过促进小胶质细胞Chi313的表达,从而影响了神经干细胞的分化。(5)DHA促进EAE模型小鼠髓鞘再生的机制主要是通过激活小胶质细胞中Axl/JAK2/STAT6通路促进小胶质细胞释放Chi313,从而激活神经干细胞EGFR受体,促进SOX10的表达,进而使神经干细胞定向分化为少突胶质细胞。5.意义本研究首次揭示了 DHA依赖于小胶质细胞发挥促进EAE模型髓鞘再生的作用;验证了其促进髓鞘再生的主要环节之一为促进内源性神经干细胞分化;揭示了其发挥作用的内在分子机制。本研究为脱髓鞘类疾病的治疗提供了新的途径,对DHA的深入研究具有重要参考价值。