棉花抗病种质缺乏和病原菌变异频繁等原因导致棉花抗黄萎病育种及综合防治成为生产上亟待解决的问题。尽管真菌的致病性和植物免疫已被广泛研究,但对于落叶型大丽轮枝菌与棉花互作机制仍知之甚少。利用多组学解析棉花与大丽轮枝菌的互作机制可为解决棉花抗黄萎病提供理论参考,通过诱导棉花免疫激活激发子的鉴定可用于抗黄萎病棉花种质创新。本研究通过双向转录组分析揭示了棉花与病原在互作过程中分子调控网络的变化,发现棉花与病原在不同侵染阶段可能的互作方式的转变。利用棉花根系与大丽轮枝菌早期互作的比较转录组和分泌蛋白组,鉴定到病原可诱导棉花免疫激活的激发子VP2。VP2在棉花中异源超量表达可提升棉花对大丽轮枝菌的抗性,实现抗黄萎病的种质创新。本研究主要结果如下:1.棉花与大丽轮枝菌互作的双向转录组分析本研究分别对落叶型大丽轮枝菌V991和非落叶型大丽轮枝菌1cd3-2侵染的棉花下胚轴进行转录组测序,并将测序所得reads分别匹配到棉花与大丽轮枝菌基因组。通过对棉花在不同时间点特异响应大丽轮枝菌的差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)的GO富集分析,发现棉花在接种后3-9 d,响应病原入侵过程中参与细胞壁合成相关路径的基因被显著富集;在接种12-21 d,棉花体内参与免疫反应等相关的基因被显著富集,并且与早期阶段相比发生明显的活性氧爆发及抗氧化酶活性的升高。进一步研究显示高浓度的过氧化氢(5 m M)能明显杀死棉花原生质体细胞。因此本研究认为棉花黄萎病的叶片黄化、坏死症状可能与ROS的过度积累有关。通过对V991和1cd3-2的比较转录组分析,发现6类与大丽轮枝菌毒力相关的基因在转录水平上的差异表达可能是引起大丽轮枝菌毒力分化的原因之一。尤其在接种后12-21 d,V991中参与毒力相关的基因被显著诱导表达。此外,大丽轮枝菌特异基因也可能是引起毒力分化的重要原因。结合大丽轮枝菌的比较基因组鉴定到V991特异分泌蛋白SP3和SP6,q RT-PCR结果显示其均在V991侵染棉花12-21 d表达升高。利用同源重组对V991基因组中的SP3和SP6进行敲除,发现SP3和SP6的敲除突变体菌丝生长速率不变,但SP3的敲除突变体对棉花的致病力明显降低,暗示着SP3可能是落叶型大丽轮枝菌导致棉花病害的关键毒力因子之一。综合棉花与病原的双向转录组分析,本研究认为棉花与大丽轮枝菌在互作过程中可明确分为两个不同的阶段:3-9 d为早期互作阶段,本阶段中植物主要依靠细胞壁等结构抗性抵抗病原菌的入侵,相应地,大丽轮枝菌在这一阶段中参与代谢和blood‐based biomarkers抑制植物免疫等相关基因被显著诱导;12-21 d为后期互作阶段,本阶段中植物体内发生了免疫反应的过度激活,这可能是导致棉花病症的主要原因之一;相应地,大丽轮枝菌在后期互作阶段分泌大量的效应子,激活植物体内的免疫反应,加速植物发病。2.利用大丽轮枝菌激发子VP2激活植物免疫,提高棉花对大丽轮枝菌的抗性V991和1cd3-2与抗病棉花品系Hai7124和感病棉花品系YZ1互作3天的比较转录组分析,显示V991在早期与棉花根系互作过程中有更多的DEMG132 IC50Gs上调表达。结合V991的分泌蛋白组,筛选到10个V991特异受诱导的分泌蛋白(VPs)。VPs注射烟草叶片48 h的q RT-PCR结果显示,VP2能显著激活烟草叶片中HR和PTI相关基因的表达。VP2在菌丝入侵早期受诱导高度上调表达,并且能诱导多种植物叶片的坏死。亚细胞定位的结果显示VP2定位在烟草细胞膜上。VIGS实验证实VP2诱导烟草叶片的坏死依赖于Nb BAK1,但不依赖于Nb SOBIR1。对VP2(VP2在V991基因组中的基因型)和ND-type VP2(VP2在1cd3-2基因组中的基因型)的蛋白序列比对分析,显示两种基因型保守性很强,仅在信号肽区域存在两个氨基酸的变异,但在入侵棉花过程中,非落叶型大丽轮枝菌中NDtype VP2几乎未被诱导。通过同源重组的方法,对V991基因组中的VP2进行敲除与回补,发现VP2敲除转化子不影响V991的菌丝生长,但对棉花的致病性明显降低,说明VP2对V991的毒力发挥重要作用。进一步,将VP2异源超表达到棉花体内,获得的VP2转基因棉花表现出对大丽轮枝菌的抗性显著增强,而不影响其生长发育。RNA-seq的结果显示,VP2转基因棉花相比野生型对照,DEGs显著富集在细胞壁修饰、对真菌的响应、木质素代谢和激素代谢等过程。参与植物免疫反应相关的基因如几丁质酶、OSM34和过氧化物酶等在VP2转基因棉花接菌前后的表达均高于野生型对照。q RT-PCR的结果显示,OEVP2转基因棉花中参与JA和SA信号转导相关基因被显著激活,JA和SA的激素含量也明显高于野生型对照。此外OEVP2转基因PEG300核磁棉花中参与木质素合成相关的基因Gh PALs在接菌前后均被显著激活,木质素含量也显著增加。以上结果表明VP2可作为一个激发子,用于棉花抗病种质创新。综上所述,本研究利用棉花与大丽轮枝菌双向转录组分析发现棉花与大丽轮枝菌的互作存在阶段性免疫调控的转变,这使我们对植物与真菌的互作有了新的认识。同时,通过对病原早期与棉花根系互作的转录组和分泌蛋白组的分析,鉴定到V991关键的激发子VP2。利用VP2转化棉花获得了抗病性显著增强的棉花新种质,丰富了创制抗黄萎病棉花种质的手段。