气虚血瘀证是缺血性心脑血管疾病发生的重要因素。目前有关血瘀证的生物学基础的研究取得了一定进展,然而,血瘀证发生及演变机制的研究还未完全明确,缺血性心脑血管疾病气虚血瘀证的生物学机制更是还有待于进一步研究。相比于血清、血浆等体液,与气虚血瘀证密切相关的机制更有可能体现在血小板中。本研究利用代谢组学方法阐释缺血性心脑血管病气虚血瘀证与血小板相关的机制。目的:采用代谢组学方法,进行缺血性心脑血管病气虚血瘀证的临床样本研究,对冠心病气虚血瘀证、脑梗气虚血瘀证的生物学基础进行整体表征,建立与临床相近的病证结合动物模型,进行拟临床研究,与临床研究结果对比,关注临床研究与基础研究的关联性以及挖掘两种疾病在同一证候下的相同代谢途径和差异代谢物,同时采用“以方测证,方证相应”的研究方法,应用补阳还五汤进行干预,挖掘其作用机制,最终以血小板的角度阐释缺血性心脑血管病气虚血瘀证的相关机制以及selleckchem补阳还五汤的作用机制。方法:本研究从病证结合研究的角度,采用代谢组学方法,对冠心病气虚血瘀证和脑梗死气虚血瘀证临床患者的血小板及血浆进行分析,以血小板为研究重点,聚焦血小板中关键代谢途径。在基础研究层面上,通过对病证结合动物模型的代谢组学研究,初步验证临床研究的结果。进一步通过以方测证的研究思路,阐释补阳还五汤的干预相应病证结合动物模型的作用机制。从而实现临床与基础研究相结合以及同证异病相整合,系统探究缺血性心脑血管病气虚血瘀证血小板的相关的发病机制。课题分五个部分:第一、二部分为冠心病气虚血瘀证的临床与基础研究。应用代谢组学技术分别对冠心病气虚血瘀证临床患者、冠心病气虚血瘀证大鼠模型的血小板及血浆样本进行研究,发掘冠心病气虚血瘀证患者与动物模型的血小板及血浆中受到影响的差异代谢物及其代谢途径,进而对临床与动物模型中共同相关的差异代谢途径进行筛选,从临床和基础两个方面探讨相关病证发病机制。第三、四部分为脑梗气虚血瘀证的临床和基础研究。研究方法与第一、二部分相同。第五部分为临床冠心病气虚血瘀证患者和脑梗气虚血瘀证患者血小板脂质组学研究。根据前期代谢组学研究结果,聚焦血小板中脂质相关途径的显著变化,采用脂质组学方法,对临床血小板样本进行定量脂质组学分析。结果:第一部分:冠心病气虚血瘀证患者血小板中有13条差异代谢途径,其中有5条主要差异代谢通路(P<0.05和impact>1):亚油酸代谢,花生四烯酸代谢,α-亚麻酸代谢,甘油磷脂代谢、鞘脂代谢。血小板中这5条主要差异代谢途径中除花生四烯酸代谢途径外,其他途径都与血浆异常代谢途径一致,表明气虚血瘀证患者的血液与血小板异常代谢途径上具有较强的关联性,对比血浆和血小板代谢途径上的标志物,共同的也以脂质类的成分居多。临床血小板的代谢组学结果具有显著性差异的主要异常代谢通路皆是脂质类成分,这提示血小板中脂质类成分代谢变化较大。第二部分:通过睡眠剥夺与心脏冠脉结扎法构建了冠心病气虚血瘀证动物模型,从中医证候指标、疾病指标及血小板参数三个方面证实冠心病气虚血瘀证模型的成功建立以及补阳还五汤可以有效干预冠心病气虚血瘀证。代谢组学结果显示,冠心病气虚血瘀证大鼠血小板中有23条差异代谢途径,其中有12条是主要差异代谢通路:亚油酸代谢,鞘脂代谢,嘌呤代谢,甘油磷脂代谢,TCA循环,谷氨酰胺和谷氨酸代谢,精氨酸生物合成,戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化,乙醛酸和二羧酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,磷酸戊糖途径以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成。血小板与血浆的代谢通路重合较多,但在血小板中富集了多个氨基酸代谢途径以及嘌呤代谢途径。对比血小板和血浆在差异代谢途径上的标志物,相同的内源性成分以脂肪酸类、氨基酸、甘油磷脂类、鞘脂类居多,表明冠心病气虚血瘀证的血浆与血小板异常代谢有一定的关联性。第一和第二部分为冠心病气虚血瘀证的临床和基础研究,对这两部分的血小板数据进行整合分析,结果显示冠心病气虚血瘀证动物模型的拟临床的差异代谢途径包括亚油酸代谢,甘油磷脂代谢,花生四烯酸代谢,鞘脂代谢,TCA循环,戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化,组氨酸代谢,牛磺酸和次牛磺酸代谢途径。亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、鞘脂代谢可能是血瘀证发病的关键机制;花生四烯酸代谢直接与血小板聚集相关,鞘脂代谢也与血小板功能异常相关;TCA循环,戊糖和葡萄糖醛酸酯相互转化,牛磺酸和次牛磺酸代谢途径则与能量代谢相关性很强,而气虚一般认为是与能量代谢相关。第三部分:临床脑梗气虚血瘀证患者血小板中有8条差异代谢通路,其中有4条主要差异代谢途径,为亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢、乙醚脂质代谢。与血浆代谢途径比较,在血浆和血小板共同的关键代谢途径是亚油酸代谢、甘油磷脂代谢、α-亚麻酸代谢。对比血浆和血小板代谢途径上的标志物,共同的以脂质类的成分居多,脂质代谢紊乱显著,在脑梗气虚血瘀证中起到重要的作用。第四部分:通过睡眠剥夺与多发性脑梗手术法构建了脑梗死气虚血瘀证病证结合动物模型,从中医证候、疾病及血小板指标证实补阳还五汤的干预作用。代谢组学分析发现脑梗气虚血瘀证大鼠血小板中有23条差异代谢通路,其中有8条主要差异代谢通路,为亚油酸代谢、鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、精氨酸生物合成、嘌呤代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢。在血Fracture-related infection浆和血小板共同的主要差异代谢途径是亚油酸代谢、鞘脂代谢、谷氨酰胺和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成。对比血小板和血浆在差异代谢途径上的标志物,在血浆和血小板中脂肪酸、甘油磷脂、鞘脂类成分、氨基酸类成分都较多,表明冠心病气虚血瘀证的血浆与血小板异常代谢有一定的关联性。第三和第四部分为脑梗气虚血瘀证的临床和基础研究,对这两部分的数据进行整合分析,结果显示气虚血瘀证脑梗死动物模型的拟临床的差异代谢途径包括亚油酸代谢,甘油磷脂代谢,α-亚麻酸代谢,鞘脂代谢,牛磺酸和次牛磺酸代谢,花生四烯酸代谢,不饱和脂肪酸的生物合成。研究结果与冠心病气虚血瘀证动物模型的拟临床的差异代谢途径基本一致。第五部分:通过血小板靶向脂质方法挖掘和归纳气虚血瘀证发病机制。其中,冠心病气虚血瘀证和脑梗气虚血瘀证共同受到调节的脂质成分55个,主要涉及到PC、PE、TG、PG、SPH、SM、Cer等几种脂类代谢途径的异常,气虚血瘀证的发病机制可能与此相关,并直接反映到心脑疾病血小板脂类组成的异常。其中以鞘脂类代谢变化最为明显,涉及到代谢通路上的SPH、SM、Cer等不同环节的成分,首次发现这类成分代谢的异常及其引起的血小板脂质组成比例的变化,可能是心、脑气虚血瘀证发病的关键机制。结论:1、临床心脑血管疾病气虚血瘀证的代谢组学结果显示,脑梗气虚血瘀证血小板样本的差异代谢通路一共有8条,而冠心病气虚血瘀证样本的差异代谢通路一共有13条,其中相同的代谢途径一共有7条显示了同证异病在血小板上的影响具有某种程度上的相似性,有亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、鞘脂代谢,牛磺酸和次牛磺酸代谢。临床心脑血管疾病气虚血瘀证的脂质组学结果显示:同一证候的两种疾病,关联性较强,结果显示两种疾病共同受到调节的脂质成分55个,主要涉及到PC、PE、TG、PG、SPH、SM、Cer等几种脂类代谢途径的异常,并直接反映到心脑疾病血小板脂类组成的异常。其中以鞘脂类代谢变化最为明显,涉及到代谢通路上的SPH、SM、Cer等不同环节的成分,气虚血瘀证的发病机制可能与此相关。反映脂质组成变化的成分如 SPH(d17:0),SPH(d19:0),SM(d40:1),SM(d42:2),SM(d34:1),SPH(t17:0),SM(d34:1),TG(18:3_10:2_11:4)等。2、病证结合动物模型的缺血性心脑血管病气虚血瘀证的代谢组学结果显示,较临床样本其在血小板中有更多的代谢途径受到影响,与临床相关性较强的是脂质相关的代谢途径。脑梗病气虚血瘀证和冠心病气虚血瘀证的动物模型血小板样本的主要差异代谢通路冠心病组为12条,脑梗死组为8条。结果显示:血小板中脂质代谢相关的亚油酸代谢,鞘脂代谢,甘油磷脂代谢异常,可能与血瘀的发生相关;而牛磺酸和次牛磺酸代谢,TCA循环,磷酸戊糖途径,谷氨酰胺和谷氨酸代谢均可涉及能量代谢,这可能是病证结合动物模型血小板中能量代谢异常的表现;精氨酸生物合成与心脑血管疾病相关;嘌呤代谢与尿酸的异常和氧化应激相关。代谢SB431542临床试验组学结果较为系统的反应了气虚血瘀证在血小板中的变化情况。3、采用“以方测证,方证相应”的研究思路,应用补阳还五汤进行干预,证明补阳还五汤可以有效治疗心脑血管疾病气虚血瘀证,在血小板干预的代谢途径为甘油磷脂代谢,鞘脂代谢,亚油酸代谢,不饱和脂肪酸的生物合成,花生四烯酸代谢,嘌呤代谢,精氨酸生物合成,谷氨酰胺和谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等。