研究背景作为全球第三大高发癌症,结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)因其高度转移的特性,对人类的生命健康安全构成了严重的威胁。目前CRC的临床治疗方法仍以手术、放化疗和靶向药为主,但总体治疗效果很难令人满意。早期发现和精准干预是确保CRC良好预后的关键,因此迫切需要更深入的机制研究,以发现CRC早期诊断的生物标志物和开发新的治疗方法。在肿瘤的生长、代谢和转移过程中,肿瘤微环境起到了至关重要的作用。而肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)作为肿瘤微环境中数量最多的基质细胞组分,其可能通过多种途径促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。研究发现基质成纤维细胞在与肿瘤细胞接触后导致自身发生代谢重编程,通过糖酵解产生乳酸为临近的肿瘤细胞提供能量代谢底物。这种乳酸在单羧酸转运蛋白(MonocarboxylatetransporterGW-572016溶解度s,MCTs)的作用下透过生物膜在癌细胞和CAFs之间进行交换的过程被称为癌症中的乳酸穿梭。乳酸一方面作为可互换的中间体在肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞之间建立代谢耦联,以维持肿瘤细胞的代谢优势;另一方面作为具有信号特性的代谢产物促进肿瘤的转移。因此关注乳酸在肿瘤微环境中的“穿梭”过程对研究其促进肿瘤转移的作用具有重要意义。在CRC肿瘤微环境中可能存在类似的乳酸穿梭过程,结直肠癌细胞可能通过与CAFs建立代谢耦联以增强自身侵袭迁移能力,但其中的具体现象和机制仍有待研究。本课题旨在研究肿瘤微环境中的结直肠癌细胞与CAFs间的乳酸代谢耦联,并从代谢角度探讨CAFs与结直肠癌细胞侵袭迁移的相关性及可能机制,同时针对CRC肿瘤微环境提出同时阻断氧化应激和乳酸穿梭过程的整体治疗思路,为CRC的抗侵袭转移治疗提供更好的理论和实践支持。实验方法和结果1.实验方法1.1结直肠癌肿瘤组织中乳酸穿梭关键蛋白MCT1表达情况(1)从TCGA和GTEx数据库中获取结直肠癌患者的MCT1基因表达数据和临床特征,分析MCT1的表达情况。(2)对常见结直肠癌细胞系的MCT1相对表达量进行分析,以确定后续研究中所用的细胞系。1.2结直肠癌细胞与CAFs的代谢耦联研究(1)在体外实验中构建间接共培养体系,使用来源于LoVo和SW480细胞的条件培养基诱导处理HFF-1细胞,平行获取的HFF-1细胞培养基作为对照组。采用免疫荧光染色分析诱导后成纤维细胞的形态变化,并检测CAFs表面标志物FAP-α、Vimentin和ACTA的蛋白及mRNA表达水平。(2)DCFH-DA荧光染色分析诱导后成纤维细胞内ROS水平变化,采用Mito-Trackerred CMXROS分析细胞线粒体质量的变化,并检测其葡萄糖吸收量、乳酸生成量、细胞内LDH活性、糖酵解关键酶LDHA和PKM2的蛋白和mRNA表达情况。(3)构建结直肠癌细胞与成纤维细胞直接共培养体系,分别使用LoVo或SW480细胞和HFF-1细胞共培养的条件培养基去诱导处理结直肠癌细胞,单独培养的LoVo或SW480细胞培养基作为对照组。检测诱导后结直肠癌细胞的线粒体质量,并分析LoVo和SW480细胞的胞内乳酸浓度、氧化磷酸化关键酶SDH和FH、乳酸穿梭关键转运体MCT1的蛋白和mRNA表达水平。1.3评价CAFs对结直肠癌进展的影响(1)细胞侵袭实验、肿瘤成球实验和细胞迁移实验考察CAFs对结直肠癌细胞LoVo和SW480的侵袭及迁移能力的影响。(2)小管形成实验研究CAFs对LoVo和SW480细胞血管形成能力影响。(3)EdU染色和MTT实验分析CAFs对LoVo和SW480细胞增殖能力的影响。1.4基于结直肠癌代谢耦联条件下对氧化应激和乳酸穿梭的干预作用研究(1)使用N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,抗氧化剂)和AZD3965(特异性MCT1抑制剂)分别抑制氧化应激和乳酸穿梭过程以解除代谢耦联,分析CAFs和结直肠癌细胞相关代谢指标的变化。(2)使用NAC和AZD3965解除乳酸代谢耦联后分析研究结直肠癌细胞侵袭、迁移和血管形成能力的变化。1.5结直肠癌细胞与CAFs代谢耦联机制的研究(1)使用TCGA和GTEx数据库对MCT1进行基因富集和通路分析,研究MCT1蛋白的生物学功能和相关活跃细胞信号途径。(2)对结直肠癌肿瘤微环境进行免疫浸润分析,研究肿瘤微环境中成纤维细胞与CAFs的细胞比例变化以及MCT4的表达情况。(3)通过Western blot实验分析NF-κB/HIF-1α在CAFs影响结直肠癌细胞侵袭迁移过程中的调控机制。1.6体内实验(1)利用Balb/c-nu裸鼠建立结直肠癌移植瘤模型,对照组注射单独培养的LoVo细胞,其他组注射预先体外共培养的LoVo和HFF-1细胞,分别给与空白溶剂、AZD3965、NAC 以及合用 AZD3965 和 NAC。(2)通过免疫组化实验分析结直肠癌组织中EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达水平,同时检测MCT1和MCT4在肿瘤间质中的分布情况。(3)分析结直肠癌组织中的乳酸浓度的变化。(4)Western blot实验检测E-cadherin、N-cadherin和MCT1等相关分子表达的情况,分析乳酸代谢耦联在结直肠癌转移中的作用。2.实验结果2.1 MCT1在结直肠癌组织中过表达(1)通过TCGA和GTEx数据库分析MCT1的表达情况,发现结直肠癌组织中MCT1的表达水平高于正常组织。针对结直肠癌转移数据库的分析则发现结直肠癌的肝脏、卵巢和腹膜转移组织中MCT1的基因表达水平高于结直肠原位癌组织,结直肠癌肺转移组织中的MCT1的基因表达水平高于正常肺组织。(2)使用CCLE数据库分析常见结直肠癌细胞系中MCT1的相对表达量,结果发现其中LoVo和SW480细胞的MCT1表达水平相对较高,故选取LoVo和SW480细胞系进行后续实验。2.2结直肠癌细胞通过氧化应激与CAFs建立代谢耦联(1)结直肠癌细胞能够诱导正常的成纤维细胞向CAFs表型转变。免疫荧光实验发现诱导后的成纤维细胞的形态有了较大改变,诱导前的细胞呈单双极形且较短,诱导后的细胞呈长梭形,放射状。RT-qPCR和Western blot的实验结果显示FAP-α、ACTA和Vimentin的mRNA和蛋白表达水平较诱导前均有增加。(2)诱导后的成纤维细胞的代谢部分转向糖酵解表型。流式细胞仪和荧光酶标仪的检测结果显示诱导后的成纤维细胞内ROS水平明显升高。接着利用荧光染料分析成纤维细胞的线粒体质量变化,发现诱导后成纤维细胞的线粒体质量有所降低,提示其代谢方式可能有所改变。通过进一步分析诱导前后成纤维细胞的葡萄糖吸收量和乳酸生成量以及细胞内LDH活性,发现诱导后的成纤维细胞葡萄糖吸收量和乳酸生成量明显增加,其细胞内LDH活性显著提升。同时通过Western blot和RT-qPCR实验分析了糖酵解中的两种关键Nirogacestat供应商酶的表达,结果显示诱导后的成纤维细胞中PKM2和LDHA的蛋白和mRNA表达水平明显提高。(3)结直肠癌细胞在与成纤维细胞建立代谢耦联后恢复部分氧化磷酸化代谢水平。首先在体外建立结直肠癌细胞与成纤维细胞的共培养体系,利用DiI荧光染料标记的两种细胞显示出了良好的生长状态。对LoVo和SW480细胞的线粒体质量以及胞内乳酸浓度的检测结果显示诱导后结直肠癌细胞的线粒体质量和细胞内乳酸浓度明显提高。免疫荧光实验同时发现直接共培养体系中的结直肠癌细胞的MCT1表达明显增加。Western blot和RT-qPCR实验发现诱导处理后的LoVo和SW480细胞中MCT1、SDH和FH的蛋白和mRNA表达水平显著升高。2.3 CAFs增强结直肠癌细胞的侵袭、迁移和血管形成能力(1)Transwell实验结果显示诱导处理后的LoVo和SW480细胞侵袭能力明显上升,肿瘤成球实验发现其肿瘤干细胞成球能力明显提高,侵袭能力增强。细胞迁移实验发现LoVo和SW480细胞的迁移能力较诱导前明显提升。对EMT过程中的关键蛋白检测发现诱导组的E-cadherin表达降低,N-cadherin和Vimentin的表达增强。(2)使用结直肠癌细胞与成纤维细胞共培养的条件培养基去培养HUVEC细胞,单独培养的结直肠癌细胞的条件培养基作为对照组,6 h后检测其成管能力,发现HUVEC的成管能力明显提升。(3)最后分别使用EdU和MTT实验分析诱导后癌细胞的增殖能力,结果显示诱导后结直肠癌细胞的增殖能力也有明显提高。2.4同时阻断氧化应激和乳酸穿梭过程能有效抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移(1)使用AZD3965处理后的结直肠癌细胞的葡萄糖吸收量和乳酸生成量明显降低,而其胞内乳酸浓度显著上升;对糖酵解关键酶的蛋白表达量检测后发现结直肠癌细胞的糖酵解水平下降。同时实验发现使用NAC处理后的成纤维细胞内ROS水平明显下降,葡萄糖吸收量和乳酸生成量恢复到正常水平。(2)同时使用NAC和AZD3965处理诱导后的结直肠癌细胞,实验结果显示其侵袭、迁移和血管形成能力明显降低。2.5 NF-κB/HIF-1α影响了结直肠癌细胞和CAFs间的代谢重编程(1)通过对MCT1的基因富集和通路分析,发现其普遍活跃的途径包括单羧酸转运、丙酮酸代谢以及三羧酸循环,表明MCT1的高表达与代谢耦联可能有着紧密的联系。(2)对结直肠癌的肿瘤微环境进行免疫浸润分析,发现结直肠癌微环境中的CAFs 比例有了明显上升,且CAFs中的MCT4表达水平较正常成纤维细胞也有明显提高。(3)Western blot实验结果显示诱导后LoVo和SW480细胞内的NF-κB/HIF-1α表达水平明显提高,而在同时使用NAC和AZD3965处理细胞后,NF-κB/HIF-1α的表达水平降低。关于EMT过程的相关蛋白检测发现,使用抑制剂处理的诱导后结直肠癌细胞的E-cadherin表达水平增加,N-cadherin的表达水平降低。2.6同时使用AZD3965和NAC能够有效抑制裸鼠皮下移植瘤的生长和侵袭迁移(1)实验结果显示注射预先体外共培养的LoVo和HFF-1细胞组的肿瘤体积和肿瘤质量明显高于单独注射LoVo细胞组,而联合给药组的疗效要好于单独给药组。同时联合给药组瘤块内的乳酸浓度较单独给药组明显提升。(2)免疫组化结果显示结直肠肿瘤组织的MCT1主要分布于上皮癌细胞,几乎不存在于周围基质中,而MCT4则主要分布在周围的基质成纤维细胞中。结果同样显示LoVo和HFF-1共培养组的EMT相关蛋白E-cadherin的表达较LoVo组降低,N-cadherinimmunity innate表达上升,而在联合给药后逆转了这种趋势。(3)瘤组织的Western blot实验结果显示LoVo和HFF-1共培养组的MCT1和N-cadherin表达水平高于单独培养的LoVo组,E-cadherin的表达低于LoVo组,同样在联合给药后逆转了该趋势。实验结论1.结直肠癌细胞通过氧化应激效应与成纤维细胞建立代谢耦联,引发自身和成纤维细胞的代谢重编程过程。2.结直肠癌细胞通过与基质成纤维细胞建立乳酸代谢耦联以增强自身侵袭、迁移和血管形成能力。3.同时阻断氧化应激和乳酸穿梭效应能有效抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移。4.NF-κB/HIF-1α影响了结直肠癌细胞和CAFs间的代谢重编程过程。