第一部分冠状病毒四重实时荧光定量PCR分型检测方法的建立及评估目的:新型冠状病毒(SARS-Co V-2)与季节性人冠状病毒(HCo V)感染的早期临床症状相似,快速准确地鉴定HCo V亚型对急性呼吸道感染的早期、精准诊疗和防控至关重要。然而,目前覆盖SARS-Co V-2的HCo V分型检测方法较少见。因此,本研究的目的是建立同时检测SARS-Co V-2、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-Co V)和四种季节性HCo V(HCo V-229E、HCo V-NL63、HCo V-HKU1和HCo V-OC43)的四重实时荧光定量PCR(qq-PCR)分型检测方法。方法:首先针对SARS-Co V-2的S、N基因、SARS-Co V的N基因、四种季节性HCo V的ORF1ab基因和人内源B2M基因设计引物和探针,然后建立并优化可同时检测SARS-Co V-2、SARS-Co V和季节性HCo V的qq-PCR分型检测方法。进一步对qq-PCR分型检测方法进行特异性和敏感性分析,并使用184份临床样本对其临床诊断效能进行了评估。结果:本研究所建立的HCo V qq-PCR分型检测方法对各目标病毒基因的最低检测限为2.5×10~1～6.5×10~1copies/μL。该方法与其他临床常见呼吸道病毒无交叉反应,组内和组间重复性的变异系数为0.5～2%,提示其具有良好的特异性和重复性。以国家药品监督管理局批准的商业化试剂盒作为参考方法,该方法对SARS-Co V-2的检测敏感性和特异性分别为91.9%和100.0%,对季节性HCo V的检测敏感性和特异性分别为95.7%和100%。检测SARS-Co V-2时,qq-PCR分型检测方法与商业化试剂盒的总检测一致性为98.4%(181/184);检测季节性HCo V时,其与商业化试剂盒的总检测一致性为98.6%(142/144)。小结:本研究建立的HCo V qq-PCR分型检测方法灵敏度高、特异性强、检测快速、成本低廉、操作简便,具有快速鉴别SARS-Co V-2和季节性HCo V的临床应用潜力。第二部分基于自动化分子诊断平台的呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR方法的建立及评估目的:本研究旨在建立一种基于自动分子检测与分析系统(Auto Molec系统)的多重实时荧光定量PCR(m RT-PCR)方法,用于9种常见呼吸道病原体的联合检测,为临床呼吸道感染的精准诊断提供一种准确快速、操作简单、连续进样、随来随检的分子诊断方法。方法:m RT-PCR方法由针对9种呼吸道病原体的3个独立的含内参的RT-PCR反应体系组成。反应体系1:肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、人珠蛋白基因(内参);反应体系2:偏肺病毒Urban airborne biodiversity(HMPV)、乙型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人18S RNA(内参);反应体系3:人副流感病毒1-3型(HPIV 1-3)、人18S RNA(内参)。采用oligo 7.6针对9种呼吸道病原体、人珠蛋白基因和人18S RNA的保守区域设计特异性引物和探针,然后基于Auto Molec系统建立并优化m RT-PCR反应体系。进一步分析该系统的特异性、敏感性和重复性,然后使用517份临床样本评估其临床表现,并与NMPA批准的商业化试剂盒进行比较。结果:建立的基于Auto Molec系统的m RT-PCR方法对9种呼吸道病原体的最低检出限为4×10~(-4)～3.3 TCID50/m L,与常见呼吸道病原体无交叉反应。重复性分析中,弱阳性和中等阳性质粒Ct值的变异系数均≤5%,阴性对照结果均为阴性。基于Auto Molec系统的m RT-PCR方法敏感性和特异性分别为99.09%和100.0%,与商业化试剂盒的总体检测一致性达99.61%,临床检测能力相当。小结:本研究成功建立了基于Auto Molec系统的m RT-PCR方法,用于9种临床常见呼吸道病原体的联合检测。该方法具有准确性高、操作简单、结果快速、连续进样、随来随检等优点,在呼吸道感染的常规筛查中具有很大潜力。第三部分2018-2020年河北省某儿童医院呼吸道感染住院患儿中人腺病毒2、3和7型流行特征分析目的:探讨河北省儿童医院呼吸道感染住院患儿中人腺病毒(ADV)2、3和7型的流行特征。方法:回顾性纳入2018年1月至2020年12月因呼吸道感染于河北省儿童医院住院治疗的儿童病例25686例,采集其深部痰液或鼻咽吸取物,使用多重PCR检测13种临床常见呼吸道病原体,并使用多重实时荧光定量PCR对采用随机数法选取的510份ADV阳性标本进行2、3和7型的分型检测。采用SPSS 21.0软件进行统计学分析,计数资料以例数和百分数表示,组间比较采用χ~2检验。结果:ADV阳性检出率为7.99%(2052/25686),3～<6岁年龄组的阳性检出率最高(11.44%),2019年ADV的阳性检出率最高(10.64%)。510份HADV阳性样本中,3型构成比最高(31.16%),其次为7型(21.37%)和2型(11.18%)。2019年ADV 2型的阳性检出率明显低于201BMS-907351小鼠8年和2020年(χ~2=8.954和16.354,P=0.003和<0.001),而3型的阳性检出率则明显高于2018年和2020年(χ~2=5.248和4.811,P=0.022和0.028)。ADV 2型在冬季的阳性检出率最低;3型在春季的阳性检出率最低,秋、冬季明显升高;7型在秋季的阳性检出率最低,冬季明显升高。ADV与其他呼吸道病原体混合检出率为43.33%(221/510),其中ADV 3型的混合检出率最高(47.32%),且2、3和7型的混合检出率均明显高于其单独检出率(χ~2=20.438,P<0.001;χ~2=42.105,P<0.001;χ~2=27.573,P<0.001)。ADV 7型(15.89%selleckchem)阳性患儿中重症肺炎的构成比高于非7型(8.23%)阳性患儿(χ~2=5.260,P=0.022)。小结:ADV是2018-2020年河北省儿童医院诊治患儿呼吸道感染的重要病原体之一,易感人群为3～<6岁学龄前儿童,易与其他呼吸道病原体混合检出;3型和7型可能是流行的优势基因型别,7型可能是儿童重症肺炎危险因素之一。结论:本研究成功建立了可快速鉴别SARS-Co V-2和季节性HCo V的HCo V qq-PCR分型检测方法和可从原始样本中同时检测9种临床常见呼吸道病原体的基于Auto Molec的m RT-PCR方法,检测快速、成本低廉、操作简便,且基于Auto Molec的m RT-PCR方法无需标准分子实验室,标本随来随检,在临床呼吸道感染的常规监测中具有很大的应用潜力。此外,本研究还发现ADV 3型和7型是目前河北省儿童医院儿童流行的优势基因型别,且7型可能是儿童重症肺炎危险因素之一,为儿童呼吸道感染的诊断、监测和防控提供了理论依据。