目的:周细胞是覆盖脑毛细血管和小静脉的壁细胞,在阿尔茨海默症、帕金森、肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病中发挥着重要作用,主要表现为周细胞丢失导致血脑屏障受损,从而激活炎症信号,影响邻近的神经血管单元,最终导致神经退变。阐明成年和老年阶段脑内影响周细胞功能的分子机制,提升周细胞的覆盖率和维持血脑屏障的完整性,可以为相关神经退行性疾病的治疗提供新的靶点。YAP(Yes-associated protein)是一种转录辅激活因子,表达于多种神经细胞,可以通过调控血管功能参与神经退行性疾病的发生发展过程。本研究证实周细胞YAP基因缺失介导的机械应力异常改变血管结构,从而导致血脑屏障受损的病理机制,并初步解释了周细胞上特异性敲除YAP基因而引发的年龄依赖性认知缺陷的原因。第一部分 周细胞YAP基因敲除导致成年小鼠出现学习记忆障碍方法:(1)构建成年慢性社交隔离病理模型,运用免疫荧光染色检测YAP基因在成年慢性社交隔离模型小鼠海马区的表达水平。(2)通过免疫荧光染色检测YAP基因在成年小鼠海马周细胞的表达情况,以及原代周细胞和周细胞系上的表达情况。(3)利用YAP~(fl/fl)小鼠和PDGFRβ-Cre ERT2工具小鼠杂交获得周细胞特异性敲除YAP基因的成年小鼠模型,通过免疫染色实验检测YAP在周细胞上的敲除效率的变化。(4)利用学习记忆相关行为学(水迷宫、新物体、新位置、三箱社交等)和运动能力相关行为学(转棒、爬杆、旷场等)及情绪相关行为学(高架十字迷宫等)检测小鼠周细胞上特异性敲除YAP基因后不同阶段(3月龄、10月龄)的行为学表型。结果:(1)YAP在成年社交隔离模型小鼠海马表达下调。通过对2月龄C57BL/6J小鼠进行为其2周的慢性社交隔离,构建社交记忆障碍的病理模型。免疫荧光染色结果表明YAP基因在成年社交隔离模型小鼠的海马表达明显下调。(2)YAP在成年小鼠海马周细胞中广泛表达。通过对成年时期C57BL/6J小鼠海马进行YAP基因和周细胞的免疫荧光共染,结果表明YAP基因在成年小鼠海马与周细胞标记物PDGFRβ存在共定位。体外利用周细胞系也同样验证YAP基因和周细胞标记物NG2、PDGFRβ、α-SMA存在共定位。同时提取2月龄原代周细胞,进行内皮细胞,周细胞和星形胶质细胞标记物免疫染色确定周细胞纯化率,并利用周细胞标记物PDGFRβ和YAP共染,观察YAP和成年原代周细胞存在共定位。(3)构建成年阶段周细胞YAP基因敲除小鼠模型。构建成年阶段周细胞敲除YAP基因的小鼠模型,在2月龄阶段腹腔注射他莫昔芬,稳定诱导一个月,通过免疫荧光染色检测周细胞上YAP基因表达情况分析其敲除效率。结果显示YAP基因的荧光强度和荧光密度出现下降,提示成年时期周细胞上特异性敲除YAP基因小鼠的成功构建。(4)成年阶段周细胞YAP基因敲除小鼠出现学习记忆障碍。行为学结果表明,3月龄和10月龄周细胞YAP基因敲除小鼠(Conditional knock out,cKO)在新物体识别实验中,适应阶段cKO小鼠和对照组小鼠偏好指数相近,表明小鼠无特定偏向;在检测阶段cKO小鼠出现了识别指数的下降,提示cKO小鼠存在工作记忆障碍。同样新位置识别中,适应阶段cKO小鼠和对照组小鼠偏好指数相近;但检测阶段cKO小鼠出现了识别指数的下降,提示cKO小鼠存在空间记忆障碍。在水迷宫实验中,训练阶段,cKO小鼠和对照组小鼠的运动速度相一致,表明两组小鼠运动能力相似,但cKO小鼠的逃避潜伏期相比较对照组更长;同时测试阶段cKO小鼠对于逃生平台的穿越次数、停留时间、逃生平台所在象限的穿越次数、停留时间相比较对照组都出现了下降,这些结果提示cKO小鼠存在长期的空间记忆障碍。另外在三箱社交实验中,适应阶段两组小鼠表现对陌生小鼠的偏好,保持正常社交能力;但在检测阶段中,cKO小鼠对于陌生小鼠的接触相比较对照组更少,表明cKO小鼠也存在社交记忆障碍。除此之外,我cKO和对照组小鼠的运动能力和焦虑情绪无差异。这些结果提示,周细胞上的YAP基因对于学习记忆具有重要作用。第二部分 周细胞YAP基因敲除对小鼠海马血脑屏障结构和通透性的影响方法:(1)通过对cKO小鼠和对照组小鼠进行三箱社交实验激活海马区神经元,运用免疫荧光检测cFos在海马区中神经细胞激活情况。(2)检测不同年龄阶段(3月龄、10月龄、22月龄)的周细胞YAP基因敲除小鼠海马的周细胞覆盖率,运用免疫荧光染色检测周细胞标记物PDGFRβ在内皮细胞标记物CD31上的覆盖面积。(3)分析成年阶段和老年阶段的周细胞YAP基因敲除小鼠海马的脑血管结构,运用免疫荧光染色检测周细胞标记物PDGFRβ和内皮细胞标记物CD31微血管结构的直径丰度、血管折叠曲折、血管断裂、血管长度和血管分支。(4)检测不同年龄阶段(3月龄、10月龄、22月龄)的周细胞YAP基因敲除小鼠海马的血脑屏障通透性,运用外源性葡聚糖示追踪和内源性纤维蛋白等手段进行免疫荧光染色检测内皮细胞周围不同分子量的外渗情况。(5)对不同年龄阶段(3月龄、10月龄、22月龄)的周细胞YAP基因敲除小鼠在海马进行内血管内皮屏障功能和旁转运功能检测,运用AQP4、ZO-1、Cluadin-5同内皮细胞标记物CD31/Glut1共染,观察血管内皮上旁转运蛋白和紧密连接蛋白的表达情况。结果:(1)周细胞YAP基因敲除降低小鼠海马区神经活性。对成年10月龄周细胞YAP基因敲除小鼠进行三箱社交实验后的海马区c Fos检测,免疫荧光染色结果表明cKO小鼠在海马区的c Fos数量和对照组相比,明显减少。同时我们具体对海马内不同区域的CA1(短期记忆)、CA2(社交记忆)、CA3(空间记忆)、DG(记忆形成)进行分析,结果表明,cKO小鼠表现出海马不同区域的c Fos激活细胞的减少。这提示我们cKO所表现出的c Fos减少和不同学习记忆相关的行为学表型相一致。(2)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马周细胞覆盖statistical analysis (medical)率减低。通过对3月龄、10月龄、22月龄不同年龄阶段的cKO小鼠进行内皮细胞和周细胞的免疫荧光染色,结果表明周细胞YAP基因敲除小鼠较对照组小鼠在不同年龄段造成周细胞覆盖率下降约60%,并且周细胞的面积都出现了下降,但是在3月龄阶段和22月龄阶段cKO小鼠并没有表现出内皮细胞面积的变化,只在成年中期10月龄cKO小鼠出现了内皮面积变化,这提示周细胞YAP基因敲除导致周细胞覆盖率下降,从而继发性影响到周细胞面积和内皮细胞面积。(3)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马血管结构异常。通过对成年3月龄和老年22月龄的cKO小鼠进行内皮细胞和周细胞的免疫荧光染色。结果表明,成年早期3月龄和老年22月龄cKO小鼠表现出周细胞和内皮细胞直径的变宽,并且出现了血管曲折层叠和周细胞的明显断裂现象。提示周细胞YAP基因敲除会导致血管结构异常。(4)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马血脑屏障通透性增加。通过对3月龄、10月龄、22月龄的cKO小鼠进行BBB功能检测,通过外源性和内源性示追踪观察内皮血管周围不同分子量外渗情况。结果表明,对于大分子量150KDa左右的鼠源Ig G,10月龄和22月龄出现了明显的lg G免疫蛋白的沉积。对于中分子量70KDa左右的内源性毒性纤维蛋白和白蛋白,3月龄、10月龄和22月龄cKO小鼠血管内皮周围出现了明显的Albumin和Fibrinogen的沉积。而对于小分子量4KDa左右的外源性葡聚糖注射,检测到3月龄cKO小鼠血管内皮周围出现了明显的FITC信号沉积。结果提示细胞YAP基因敲除导致血脑屏障功能障碍,并且以年龄依赖性方式导致外渗严重。(5)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马血管内皮屏障和旁转运功能减退。通过对3月龄、10月龄、22月龄的cKO小鼠通过内皮屏障的紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5以及内皮和星形胶质细胞之间旁转运蛋白AQP4进行免疫荧光染色检测。结果表明,在3、10、22月龄不同阶段,周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马出现血管内皮屏障和旁转运功能相关蛋白含量下降。第三部分 周细胞YAP基因敲除对小鼠海马血管炎症和神经炎症的影响方法:运用免疫荧光染色检测3月龄、10月龄和22月龄的周细胞YAP基因敲除小鼠中内皮细胞标记物CD31、Glut1同小胶质细胞标记物Iba1和星形胶质细胞标记物GFAP的表达情况,观察血脑屏障功能异常造成的血管炎症和神经炎症的水平。结果:(1)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马血管性炎症。通过免疫荧光检测海马血管内皮上覆盖的炎症信号标记物GFAP和Iba1,结果表明,3月龄、10月龄和22月龄阶段cKO小鼠海马GFAP~+和Iba1~+细胞密度在内皮细胞面积上出现了明显的增多。提示周细胞YAP基因敲除导致微血管内皮屏障和内皮细胞紧密连接受到破坏,红细胞渗出,白细胞浸润脑实质,引发血管性炎症。(2)老年阶段周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马以年龄依赖性方式引起神经炎症,并且验证神经炎症迟发于血管性炎症。通过免疫荧光实验检测海马炎症细胞标记物GFAP和Iba1的细胞密度,结果表明,成年3月龄MEK抑制剂、10月龄阶段cKO小鼠海马Iba1~+细胞密度出现增加,但是GFAP~+细胞密度没有变化。而在老年阶段22月龄cKO小鼠Iba1~+和GFAP~+细胞密度都出现增加。提示成年时期周细胞YAP基因敲除会导致轻微的神经炎症,并且神经炎症是迟发于血管性炎症的。随着衰老进程,周细胞YAP基因敲除在老年阶段表现出严重的神经炎症。第四部分 周细胞YAP基因敲除对小鼠海马少突胶质细胞谱系细胞和髓鞘蛋白的影响方法:运用免疫荧光染色检测3月龄、10月龄和22月龄的周细胞YAP基因敲除小鼠海马组织的Olig2~+PDGFRα~+细胞,观察少突胶质细胞祖细胞的增殖能力;CC1~+和ASPA~+免疫荧光染色检测少突胶质细胞成熟分化能力;MBP~+NF200~+免疫共染检测髓鞘蛋白更新和再生。同时利用Western Blot手段探究海马MBP、MAG髓鞘相关蛋白表达。结果:(1)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马少突胶质细胞祖细胞的增殖能力下降。通过免疫荧光检测海马少突胶质细胞祖细胞标记物Olig2~+PDGFRα~+双阳性细胞,结果表明,3月龄、10月龄和22月龄阶段cKO小鼠海马均出现了少突胶质细胞祖细胞密度减少,提示周细胞YAP基因敲除会影响少突胶质细胞祖细胞增殖能力。(2)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马少突胶质细胞成熟迟缓。通过免疫荧光检测海马少突胶质细胞标记物CC1~+和ASPA~+阳性细胞,结果表明,3月龄、10月龄和22月龄阶段cKO小鼠海马均出现了少突胶质细胞密度减少,提示周细胞YAP基因敲除会影响少突胶质细胞祖细胞成熟分化能力。(3)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马髓鞘更新和再生能力下降。通过免疫荧光检测海马髓鞘蛋白标记物MBP~+NF200~+,结果表明,3月龄、10月龄和22月龄阶段cKO小鼠海马均出现了髓鞘蛋白表达下降,并且通过Western Blot检测海马髓鞘相关蛋白MBP、MAG,结果进一步证明cKO小鼠海马出现了髓鞘蛋白表达下降。提示周细胞YAP基因敲除会影响少突胶质细胞祖细胞成熟分化能力。第五部分 周细胞YAP基因敲除对小鼠海马神经元及轴突的影响方法:通过对3月龄、10月龄和22月龄的周细胞YAP基因敲除小鼠进行NF200~+免疫荧光染色检测轴突变性情况;Neu N~+免疫荧光染色检测神经元变化。结果:(1)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马出现神经退变。通过免疫荧光检测海马神经元标记物Neu N~+细胞,结果表明,3月龄阶段cKO小鼠海马和对照组的神经元密度没有变化。但10月龄和22月龄阶段cKO小鼠海马相比较对照组,神经元密度明显降低,提示随着衰老进程,周细胞YAP基因敲除会影响到神经元密度,从而导致神经退变。(2)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马出现轴突变性。通过免疫荧光检测海马神经丝标记物NF200~+,结果表明,3月龄、10月龄阶段cKO小鼠海马并未出现差异变化,但22月龄阶段cKO小鼠海马相比较对照组出现了NF200荧光强度下调。提示周细胞YAP基因敲除使小鼠以年龄依赖性方式影响海马的轴突变性。结论:(1)YAP基因在成年小鼠海马的周细胞中广泛表达。周细胞YAP基因敲除会导致成年小鼠出现学习记忆功能障碍。(2)周细胞YAP基因敲除导致小鼠海马周细胞覆盖率,血管收缩功能以及血脑屏障通透性呈现年龄依赖性下降。(3)周细胞YAP基因敲除LXH254溶解度造成血脑屏障渗漏而引发血管性炎症和神经炎症。(4)周细胞YAP基因敲除诱发的神经血管炎症导致少突胶质细胞谱系细胞更新迟缓和髓鞘再生受损。(5)周细胞YAP基因敲除影响髓鞘变化,造成神经元受损和轴突变性,引发神经退变。据此,本研究利用周细胞特异性小鼠模型,通过多种检测手段,分别从脑内血管结构功能和邻近神经血管单元的响应变化来分析YAP介导周细胞对血管性疾病的协同保护作用及机制。