叶绿体作为光合作用和多种物质生物合成的场所,在植物生长发育中发挥重要功能。叶绿体蛋白质组学的研究对于深入了解叶绿体在光合作用过程中所执行的功能有重要意义。目前叶绿体的蛋白质组学信息已存入多个独立的数据库,但是对于叶绿体被膜蛋白质组的研究仍然是一个艰巨的挑战,构成这一功能性双膜系统的许多蛋白质仍有待鉴定。通道/转运蛋白是被膜蛋白的重要成员,其嵌入在磷脂双分子层中,在渗透调节、生长、信号传递、运动、根的养分获取等过程中发挥着重要作用。本研究主要通过菠菜叶绿体被膜蛋白质组学分析,筛选出两个候选叶绿体被膜蛋白DUF1(Domain of Unknown Function 1)与DGSI-IX小鼠UF2,并利用分子生物学和遗传学等手段对其功能进行了研究,结果和结论如下:(1)通过对菠菜叶绿体被膜Kidney safety biomarkers质谱学分析并与已发表的叶绿体被膜蛋白质谱数据(Bouchnak et al.,2019)比较,在本工作中筛选出148个候选叶绿体被膜蛋白。(2)为了寻找离子转运相关的蛋白,对筛选到的转运功能相关的蛋白进行分析,鉴定到两个蛋白DUF1与DUF2。DUF1/2均存在电压门控钾通道超家族结构域与CASTOR/POLLUX结构域,LEE011试剂并且DUF1/2蛋白均存在跨膜结构域。亚细胞定位分析DUF1/2定位于叶绿体被膜。(3)DUF1/2蛋白三维结构与日本莲中CASTOR通道结构相似,通过原核诱导表达DUF1截短蛋白并通过分子筛纯化,发现DUF1蛋白在体外以四聚体状态存在,与预测的DUF蛋白结构吻合。表明DUF蛋白可能作为叶绿体被膜离子通道发挥功能。(4)分别获得DUF1与DUF2的T-DNA插入突变体株系(duf1与duf2),两个突变体株系生长表型与野生型一致,光合功能未受影响。经过转录水平的鉴定,确定duf1与duf2分别为DUF1与DUF2的拟南芥基因敲除株系。(5)通过半定量PCR以及荧光定量PCR分析DUF1与DUF2在拟南芥中组织表达模式,发现DUF1与DUF2基因在根、茎、叶、花和幼嫩果荚中均有表达,特别在叶片中表达量较高,根的表达量较低。(6)对DUF蛋白及其同源蛋白的系统发生分析,发现DUF蛋白在进化过程中比较保守。通过氨基酸序列比对,发现拟南芥DUF1与DUF2蛋白高度同源,推测DUF1与DUF2基因功能冗余。(7)通过杂交法获得duf1duf2双突变体。钙离子动力学水平检测表明DUF1/DUF2功能的丧失影响应激诱导的基质钙离子释放。综上所述,本研究通过叶绿体被膜蛋白质组学分析,筛选出两个叶绿体被膜蛋白DUF1与DUF2,DUF1/2可能作为离子通道蛋白调控基质钙离子释放。DUF1/2的发现为叶绿体被膜转运体家族增加了新成员,并使我们能够在未来的工作中更好的理解钙信号的作用。