背景:食管高级别鳞状上皮内瘤变(High-grade intraepithelial dysplasia,HGD)为食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell cancer,ESCC)的癌前病变,探索HGD早期发育的分子和细胞特征有助其早期诊治,可显著提高ESCC患者的生存率。研究表明,肿瘤早期分子和细胞特征与其细胞起源及微环境组成有关;然而,人食管HGD的细胞起源及微环境特征尚不清楚。因此,解析人食管HGD的细胞起源及微环境特征,将为理解食管鳞癌的发生及其早期防治提供新的策略。目的:探讨人食管高级别鳞状上皮内瘤变的细胞起源、分子特征及微环境特征。研究方法:(1)通过单细胞转录组测序技术(Single cell RNA sequencing,sc RNA-Median paralyzing doseseq)构建人食管HGD及其瘤旁正常组织的单细胞转录组图谱,通过无监督聚类分析明确其细胞组成及分布以进行下一步分析;(2)采用无监督聚类和组织切片染色技术分析正常食管上皮细胞的转录组和空间异质性,并通过细胞干性及拟时序分析探索潜在的食管干细胞及正常上皮细胞的分化路径;(3)通过原代细胞培养技术联合核型分析来确定瘤旁正常组织和HGD组织中的非整倍体细胞,然后通过Copy KAT完全无监督地识别数据集中的非整倍体细胞,进而准确从所有上皮细胞中鉴定并注释肿瘤细胞;(4)通过特征标志基因表达相似性、整体转录组相似性、关键转录因子表达相似性、功能状态基因集富集相似性和拟时序分析等多种方法来阐明HGD肿瘤细胞与正常细胞间的谱系发育关系;(5)通过HGD与ESCC的单细胞转录组数据整合分析、bulk转录组数据、特征基因的组织切片染色实验和3D类器官功能实验等,分析HGD的转录组及功能特征;(6)通过生物信息学方法分析HGD及瘤旁组织的微环境细胞组成和功能特征;结果:(1)人食管HGD及瘤旁组织的单细胞转录组图谱显示:HGD及瘤旁组织伴随大量免疫细胞(特别是T/NK细胞)浸润,同时HGD组织中富集了Treg细胞亚群、炎性的单核细胞亚群,但经典的DC细胞减少;此外,单细胞图谱中没有发现组织类型特异性的上皮细胞群体;(2)人正常食管包含4种鳞状上皮细胞:缓慢增殖的基底层细胞、快速增殖的基底层细胞及2种基底上层分化细胞;其中,缓慢增殖的(KRT15~(high)STMN1~(low))和快速增殖的(KRT15~(high)STMN1~(high))基底层细胞不仅存在转录组异质性,同时在空间分布上也存在异质性(分别分布于乳头间区和乳头区);正常食管上皮分化细胞池由2种基底层细胞同时维持,但KRT15~(high)STMN1~(low)亚群更具干性特征;(3)HGD肿瘤细胞与正常食管鳞状上皮细胞在聚类特征上存在相似性,但基于其非整倍体特征,Copy KAT准确的捕获Antineoplastic and I抑制剂到单细胞数据中的HGD肿瘤细胞;(4)HGD肿瘤细胞高表达正常基底层细胞标记KRT15,提示其可能起源于基底层细胞;HGD肿瘤细胞(包括各亚群)在整体转录组上与缓慢增殖的基底层细胞最相似(Pearson相关系数为0.93～0.95);在关键转录因子表达和特征功能基因集富集上,HGD肿瘤细胞也与缓慢增殖的基底层细胞最相似;此外,在拟时序轨迹上,HGD肿瘤细胞也和缓慢增殖的基底层细胞相拟合;这些结果表明,HGD最有可能起源于缓慢增殖的(KRT15~(high)STMN1~(low))基底层细胞;(5)HGD肿瘤细胞类似于正常基底层细胞:保留了基底层细胞特征并具有部分分化能力(不全分化),但这些特征将随着肿瘤发生浸润而消失;(6)人食管HGD微环境是免疫老化状态下、以炎性伴抑制性为特征:CD8+T细胞未被充分激活,而活化的CD4+T细胞向Treg方向极化;持续的单核细胞募集伴炎性转换;巨噬细胞具有明显的M2极化特征。结论:本研究全面构建了人食管HGD及瘤旁组织的单细胞转录组图谱。以此为基础:证实了人食管基底层细胞在转录组和空间位置上的异质性,且缓慢增殖的(KRT15~(hselleck NMRigh)STMN1~(low))基底层细胞亚群更具干性特征;HGD肿瘤细胞可能起源于缓慢增殖的(KRT15~(high)STMN1~(low))基底层细胞亚群;HGD肿瘤细胞保留了基底层细胞分子特征,并具有部分分化能力(不全分化),但这些特征会随着肿瘤浸润而消失;此外,未充分激活的CD8~+T细胞亚群,免疫抑制性的CD4~+T细胞亚群,和炎性的单核细胞亚群等共同构成了HGD炎性的、免疫抑制性的微环境。本研究为理解人食管HGD早期发育,在分子及细胞学层面提供了全面见解;将为食管癌早期防治提供新的策略。