背景:宫颈癌是一个全球性的健康问题,给社会带来相当大的经济和医疗负担。因此,有必要共同努力改善宫颈癌的治疗。尽管目前有多种治疗方案可用于治疗宫颈癌,如放化疗和新辅助化疗或辅助化疗,但局部复发和远处转移的比例不断增加,且晚期不能手术的宫颈癌治疗仍然是一个具有挑战性的问题。此外,不适合根治性治疗的复发性宫颈癌以及新发转移性宫颈癌被认为无法治愈,预后不佳。近年来,天然植物中药提取物的有效成分由于具有多渠道、多环节、多靶点、毒性小等诸多优势,已成为新化疗药物开发研究的热点。同时中药治疗肿瘤的机理是身心调理、通过扶正祛邪来提高机体的免疫力、抑制肿瘤的快速发展,达到人体和肿瘤的共生状态。基于我们前期的研究发现,从天然植物中药白芷中提取的单体Laduviglusib别欧前胡素具有一定的抗癌活性。在此研究背景下,进一步探索别欧前胡素的抗癌机理,为宫颈癌新化疗药物的开发研究奠定基础。目的:(1)验证别欧前胡素在体内和体外的抗癌活性;(2)探索别欧前胡素通过线粒体和死亡受体通路对宫颈癌He La和Si Ha细胞凋亡的影响;Bioactive metabolites(3)探索别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞发生氧化应激,以及活性氧与细胞死亡的关系;(4)研究别欧前胡素通过氧化应激调控内质网应激以及GRP78/PERK/DDIT3通路诱导宫颈癌Wnt-C59半抑制浓度He La和Si Ha细胞发生自噬;(5)通过生物信息学进一步揭示内质网应激蛋白GRP78的编码基因HSPA5在宫颈癌中的生物学功能、预后、免疫学价值。方法:(1)CCK-8细胞毒性实验检测不同浓度下别欧前胡素对宫颈癌细胞系He La、Si Ha、MS-751、Caski和正常宫颈Hcer Epic细胞增殖的影响;高内涵高通量动态检测系统、3D微球细胞模型建立、平板克隆实验检测不同浓度的别欧前胡素对宫颈癌He La和Si Ha细胞增殖能力的影响;(2)流式细胞技术检测别欧前胡素对宫颈癌He La和Si Ha细胞周期和凋亡的影响;(3)细胞划痕实验、高通量动态拍摄系统检测别欧前胡素对宫颈癌He La和Si Ha细胞迁移能力的影响;(4)Western Blot检测别欧前胡素对He La和Si Ha细胞周期蛋白Cyclin B和CDC2以及基质金属蛋白MMP-2、MMP-9的表达的影响;(5)建立BALB/c裸鼠宫颈癌He La细胞荷瘤模型,验证别欧前胡素对宫颈癌He La细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用和裸鼠的生存状态;免疫组化、Western Blot验证别欧前胡素对瘤体组织中凋亡蛋白Caspase-3、-8和自噬蛋白LC3、p62的影响;(6)JC-10荧光探针在高内涵高通量成像系统下检测别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞凋亡和线粒体势能膜电位的变化;透射电镜检测别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞凋亡结构(即凋亡小体)改变;实时荧光定量PCR和Western Blot验证凋亡通路上核心蛋白和m RNA的表达;(7)DCFH-DA活性氧荧光探针结合激光共聚焦检测别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞中活性氧(ROS)的产生;免疫荧光显微镜检测别欧前胡素对宫颈癌He La和Si Ha细胞中LC3自噬荧光的产生;构建m RFP-GFP-LC3慢病毒稳转宫颈癌He La和Si Ha细胞株,通过激光共聚焦检测别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞自噬流的产生;透视电镜检测别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞自噬结构的改变(自噬小体);Western Blot检测别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞中自噬蛋白LC3、p62、ATG5、ATG12和内质网应激蛋白GRP78、PERK和e IF2α、DDIT3的表达;通过si RNA GRP78转染实验,验证别欧前胡素通过GRP78/PERK/DDIT3通路在He La和Si Ha细胞中调控的自噬诱导;(8)通过生物信息学分析了GRP78的编码基因HSPA5基因注释文件,从Gene Cards?数据库获得HSPA5基因的详细信息;从HPA数据库获得HSPA5基因在细胞中的位置信息;通过TCGA数据库分析HSPA5基因在泛癌中的表达,证实HSPA5基因在宫颈癌中的高表达;(9)通过在线数据库免疫组织化学、q-PCR、Western Blot验证了HSPA5基因在宫颈癌中的表达以及参与的细胞生物学行为、肿瘤免疫浸润、免疫检查点调控、敏感性靶点药物和临床预后。结果:(1)与对照组相比发现,别欧前胡素在不同浓度下抑制了宫颈癌He La、Si Ha、MS-751、Caski细胞的增殖,但对He La和Si Ha细胞的抑制作用最明显,对正常宫颈上皮Hcer Epic细胞无明显抑制作用,同时有效抑制了宫颈癌He La细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,对裸鼠的生存状态无明显影响;(2)与对照组相比,我们发现别欧前胡素抑制了He La和Si Ha细胞的迁移、阻滞了细胞周期、抑制了基质金属蛋白MMP-2、MMP-9和细胞周期蛋白Cyclin B、CDC2的表达;(3)别欧前胡素降低了宫颈癌He La和Si Ha细胞线粒体膜电位、诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞凋亡荧光的产生;透视电镜结果证明,别欧前胡素诱导He La和Si Ha细胞凋亡结构(凋亡小体)的改变;实时荧光定量PCR和Western Blot结果发现,别欧前胡素诱导了内源性凋亡通路蛋白Caspase-8、-9、Bax及Cyt-c和外源性凋亡通路蛋白Fas、FADD和Caspase-3的表达,下调Bc L-2、PARP、Pro-caspase-3、Pro-caspase-8、Pro-caspase-9的表达;(4)裸鼠瘤体免疫组化结果证实,别欧前胡素诱导瘤体组织中凋亡蛋白Caspase-3、-8的表达;(5)别欧前胡素诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞氧化应激的发生,促进了活性氧(ROS)的产生;(6)与对照组比较,别欧前胡素诱导了宫颈癌He La和Si Ha细胞LC3自噬荧光的产生;m RFP-GFP-LC3慢病毒转染实验结果证实,别欧前胡素诱导了He La和Si Ha细胞自噬流的产生;(7)透视电镜结果证明,别欧前胡素诱导He La和Si Ha细胞自噬结构(自噬小体)出现;(8)Western Blot结果证实,别欧前胡素诱导自噬蛋白LC3、ATG5、ATG12的表达,降低了p62蛋白的表达;别欧前胡素诱导了内质网应激的发生,伴随着内质网应激蛋白GRP78、PERK、e IF2α、DDIT3蛋白的表达升高,加入活性氧抑制剂(NAC)后,LC3、ATG5、ATG12和GRP78蛋白的表达降低,而p62蛋白的表达升高,说明氧化应激参与调控了内质网应激诱导的自噬;(9)si RNA转染实验结果,我们发现He La和Si Ha细胞转染si RNAGRP78后,GRP78的表达较对照组显著降低,同时别欧前胡素处理组中的PERK、DDIT、LC3的表达也降低,说明GRP89/PERK/DDIT3通路参与了别欧前胡素调控的自噬;(10)免疫组化结果表明,别欧前胡素诱导瘤体组织中自噬蛋白LC3的表达,降低了p62蛋白的表达;(11)生物信息学分析结果证实,HSPA5基因编码的蛋白质是热休克蛋白70(HSP70)家族的成员,该蛋白定位于内质网内腔,位于染色体9q33.3;HSPA5基因在细胞中主要位于细胞质内;(12)HSPA5基因在宫颈癌中高表达,参与调控宫颈癌的生物学功能;(13)HSPA5基因在宫颈癌中与患者的预后和总生存期呈负相关;参与调控多个免疫检查点和多种免疫细胞浸润;(14)HSPA5基因的表达量与cg14190817位点甲基化程度显著负相关;HSAP5基因与参与调控6种敏感化疗靶向药物。结论:(1)别欧前胡素通过线粒体和死亡受体通路诱导宫颈癌He La和Si Ha细胞凋亡从而发挥抗癌作用,在体内也显示出了抗癌活性;(2)别欧前胡素通过氧化应激调控内质网应激及GRP78/PERK/DDIT3通路调控宫颈癌He La和Si Ha自噬的发生;(3)GRP78的编码基因HSPA5参与了宫颈癌的预后、免疫相关检查点、细胞免疫浸润和宫颈癌的甲基化,是宫颈癌的一种潜在临床诊断标志物。