【研究背景】香味是作物的重要食味品质之一,深受消费者的青睐。例如香米,由于其所具有的独特香味,表现出比普通大米更高的商品价值。2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2-AP)是香米的主要香味物质,而在普通大米中很难检测到该物质的存在。BADH2是控salivary gland biopsy制水稻等作物香味性状的关键基因,该基因功能缺失后稻米可以产生香味。玉米是我国第一大粮食作物,但具有香米味道的香型玉米品种或种质却鲜有报道.通过生物信息学分析发现,在玉米基因组中存在2个BADH2基因。由于BADH2控制的香味性状为隐性,如果要获得香型玉米材料,2个玉米BADH2必须同时发生功能缺失突变,因此通过常规手段获得香型玉米种质难度较大。【材料与方法】利用Ensembl数据库在线BLAST工具,将水稻OsBADH2蛋白序列在拟南芥、水稻和玉米蛋白序列数据库中进行序列比对,获得上述3个物种的BADH基因家族成员,并利用UniProt蛋白数据库中的结构域信息进行验证。进一步使用MEGA软件进行系统进化分析,获得玉米BADH2同源基因作为候选编辑靶标。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理,在候选基因的外显子处设计特异性靶点,并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体。再以玉米自交系京724为受体,利用农杆菌介导的遗传转化方法,通过磷酸甘露糖异构酶基因(Phosphomannose isomerase,PMI)抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在靶基因中产生的突变类型。利用气相色谱质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测基因编辑株系T1籽粒中香米主要香味物质2-AP的含量,以确认京724在基因编辑前后2-AP含量的变化。【结果与分析】通过系统进化及蛋白结构域分析,发现玉米中存在2个BADH2同源基因,分selleck HPLC别命名为Zm BADH2-1和Zm BADH2-2。Zm BADH2-1位于第4染色体,ZmBADH2-2位于第1染色体。2个基因均包含15个外显子和Elexacaftor MW14个内含子,第4外显子间的核苷酸序列高度同源。在2个基因的第4外显子区域设计靶点并构建入CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过遗传转化获得28个转基因株系。PCR扩增及测序分析结果显示,其中10株材料的2个ZmBADH2s在靶点区域均发生突变,突变基因型包括双等位突变和多等位突变,突变类型为不同数量的碱基缺失和插入。这些突变使2个ZmBADH2s的蛋白翻译发生不同形式的移码或氨基酸缺失。质谱检测结果显示玉米ZmBADH2双基因突变体籽粒中存在与香稻同样成分的2-AP。随机选取的4个T1代基因编辑株系籽粒中,2-AP平均含量分别为438.29、404.63、348.65和161.82μg·kg-1,而未经过编辑的京724中未检测到2-AP;【结论】利用CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBADH2-1和ZmBADH2-2同时进行定点敲除,获得ZmBADH2s双基因突变体,创制出籽粒中具有香米味道的玉米骨干亲本新种质材料。