抗菌肽一般泛指具有抗菌活性的小分子多肽,其来源广泛、序列多样而且对于细菌、真菌、病毒等多种病原体具有杀灭作用以及免疫调节作用,是一种极具研发前景的抗生素替代品。新型抗菌肽通常是从生物体上直接分离纯化获得的,其来源单一、操作复杂。合成生物学为大量挖掘新型抗菌肽提供了技术基础,使用蛋白质定向进化技术进行高通量筛选能够为抗菌肽的开发提供大量先导抗菌肽。抗菌肽的高合成成本是限制其发展为临床药物的另一大难题,将抗菌肽与载体蛋白融合后进行异源表达是抗菌肽工业生产中的常用方法,而基于内含肽的融合表达已被证实能够获得具有生物活性的抗菌肽。本研究利用蛋白质定向进化技术构建随机肽库,并通过细菌表面展示技术在生理相关条件下对随机肽库进行筛选,筛选获得了数十种新型抗菌肽;同时利用内含肽表达系统以商用型大肠杆菌表达菌株为载体实现了抗菌肽融合蛋白的可溶性表达,融合蛋白裂解后释放的抗菌肽具有一定的抗菌活性,主要结果如下:1、构建了基于细菌表面展示技术的抗菌肽活性检测体系以E.coli DH5α为宿主菌,以含有阿拉伯糖启动子的p BAD33为载体,构建含有Lpp锚定蛋白、Omp A跨膜蛋白、柔性系链以及C端抗菌肽四个部分的细菌表面展示系统。使用已知具有革兰氏阴性菌杀伤活性的天蚕素P1验证该系统,结果表明基于细菌表面展示技术的抗菌肽活性检测体系构建成功。2、构建了短肽随机突变文库,筛选selleck HPLC获得了一系列新型抗菌肽使用简并密码子合成长度为75bp的高通量突变引物,将该单链DNA片段经PCR扩增为双链后与上述抗菌肽活性检测系统连接生成一个随机文库。DNA序列测定结果表明该文库包括随机突变,且文库成员的序列长度并Genetic admixture未局限于设定的25个氨基酸残基,具有高度多样性。在阿拉伯糖诱导条件下,测量文库各转化子在600nm处的OD值,挑取OD值低于空载对照的转化子并进行排序。选取排序前15%的阳性转化子测定其DNA序列,共发现26个具有抑菌活性的多肽序列。与抗菌肽数据库进行对比,发现筛选所得抗菌肽均为新型抗菌肽。而且筛选所得的新型抗菌肽与天然抗菌肽的氨基酸构成、疏水性分布存在一定差异。3、利用内含肽融合表达系统实现了抗菌肽融合蛋白的可溶性表达本研究选取了来源、结构各异的六种抗菌肽,分别构建了N端融合蛋白his-SUMO-Intein-AMP与C端融合蛋白AMP-Intein-SUMO-his,并以质粒p ET28a为表达载体,转入E.coli BL21菌株中表达,将细菌破碎后收集上清,进行SDS-PAGE发现,六种融合蛋selleck产品白均可实现可溶性表达。4.通过内含肽水解获得了具有活性的抗菌肽对上述抗菌肽融合蛋白进行大量表达纯化,获得了his-SUMO-Intein-Lfcin B、his-SUMO-Intein-PG 1、CAD-Intein-SUMO-his、Lfcin B-Intein-SUMO-his四种融合蛋白。对纯化后的N端融合蛋白通过改变其缓冲液的p H值诱导内含肽自裂解,而对C端融合蛋白通过添加DTT诱导内含肽自裂解,对裂解产物进行牛津杯抑菌圈试验发现采用C端融合方式的CAD、Lfcin B能够有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的生长。生长曲线测定试验结果与抑菌圈试验结果一致,表明能够通过内含肽裂解获得具有活性的抗菌肽。