背景早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)是指女性40岁前出现卵巢功能减退,全球发病率3.7%。POI不仅影响女性生育,还易引发全身多系统疾病,如骨质疏松、代谢异常、心血管疾病等,是一种严重影响女性身心健康的生殖障碍性疾病。由于POI发病隐匿,进展迅速且缺乏早期预警指标,多数患者就诊时就已丧失生育机会。因此,进行POI病因和发病机制研究对于该疾病的预防和早期诊疗意义重大。POI病因高度异质,其中遗传因素约能解释20-25%的POI患者,是POI病因学研究的重点。随着近年来高通量测序技术的飞速发展,POI致病基因挖掘获得突破性进展,值得注意的是,多数新发现的POI致病基因与卵母细胞减数分裂进程相关。卵母细胞在女性胚胎期开始进入减数分裂,在完成第一次减数分裂前期程序性双链DNA断裂(double strand break,DSB)、同源重组修复(homologous recombination,HR)和同源染色体联会等关键事件后,停滞于第一次减数分裂前期的双线期,并与周围体细胞组装形成原始卵泡,原始卵泡池大小决定了女性的生殖寿命。减数分裂进程异常可引起卵母细胞凋亡,卵巢储备提前耗竭。目前已发现超过20个减数分裂基因突变参与POI发生,包括BRCA2、SPATA22、MEIOB、MSH4、HSF2BP和SYCE1等,主要影响减数分裂同源重组和联会环节。而程序性DSB的产生作为减数分裂的起始事件,是卵母细胞同源染色体进行精确重组修复和联会的基础。多数减数分裂DSB形成基因敲除小鼠,出现卵母细胞DSB形成异常和重组、联会缺陷,卵母细胞大量凋亡,小鼠出生后卵巢功能障碍,如Prdm9-/-、Spo11-/-、Rec114-/-和Ankrd31-/-。尽管动物表型支持DSB形成基因与卵巢功能维持相关,但DSB形成基因在人类POI发病中的作用仍有待明确。本项研究中,我们通过在中心自有POI全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)数据库(纳入1030例POI患者)中进行减数分裂DSB形成相关基 因 的突变筛查,包括SPO11、PRDM9、EWSR1、MEI1、MEI4、IHO1、ANKRD31、REC114和TOPOVIBL,共发现PRDM9、ANKRD31和MEI4基因的7个潜在致病变异。本研究分别对上述基因突变开展了体内、体外功能实验,探讨突变在POI发生发展中的致病机制。研究结果进一步拓展了 POI致病基因谱,为阐明减数分裂DSB形成基因在卵巢储备建立和功能维持中的调控机制提供了重要理论依据。第一章减数分裂DSB形成基因PRDM9、ANKRD31突变在POI发病中的作用及机制研究目的明确减数分裂DSB形成基因PRDM9、ANKRD31突变在POI发病中的作用,并揭示其致病机制。方法筛查本中心1030例POI-WES数据库,发现减数分裂DSB形成基因PRDM9、ANKRD31突变。构建PRDM9和ANKRD31野生型及突变型质粒,在HEK293细胞中过表达,利用免疫荧光染色检测PRDM9突变型蛋白的细胞定位,Western blot检测PRDM9突变蛋白的甲级转移酶活性,免疫共沉淀检测ANKRD31突变蛋白与REC114的结合能力。同时,通过Minigene剪切位点验证体系,探究ANKRD31剪切位点变异对mRNA剪切的影响,并通过Prdm9+/-小鼠卵巢体外培养,探究突变影响卵巢功能的剂量效应。结果共发现7例POI患者分别携带PRDM9(NM_020227.3:c.229C>T,p.Arg77*;c.638T>G,p.Ile213Ser;c.677A>T,p.Lys226Met)、ANKRD31(NM_001164443.1:c.1565-2A>G;c.985C>T,p.Gln329*)杂合潜在致病突变。细胞实验证实,PRDM9 p.Arg77*突变影响蛋白入核,3种突变均显著降低PRDM9蛋白的甲基转移酶活性;ANKRD31 p.Gln329*截短突变影响其与关键DSB形成蛋白REC114的结合,剪切位点突变c.1565-2A>G引起ANKRD31 mRNA异常剪切。卵巢体外培养结果显示,Prdm9+/-小鼠卵母细胞对凋亡诱导物的敏感性升高,Decitabine IC50卵母细胞凋亡数目较野生型明显增加。结论本研究首次在中国汉族POI患者中发现PRDM9和ANKRD31基因突变,并通过功能实验证实PRDM9突变影响蛋白入核及蛋白的甲基转移酶活性;ANKRD31突变导致mRNA异常剪切,并影响其与互作蛋白结合。以上杂合突变可能通过单倍剂量不足效应引发减数分裂DSB形成异常,影响卵巢储备建立和功能维持,最终参与POI的发生发展过程。第二章减数分裂DSB形成基因MEI4突变对卵巢储备功能的影响及在POI发病中的机制研究目的探究减数分裂DSB形成基因MEI4突变对卵巢储备功能的影响及在POI发病中的作用机制。方法在1030例POI-WES数据库中筛查获得MEI4基因突变。构建MEI4野生及突变质粒,在HEK293细胞系中过表达,利用免疫共沉淀检测突变蛋白与关键互作蛋白REC114的结合能力。构建p.Gln 356*同源突变酵母菌株,观察突变对孢子存活的影响。通过统计不同时刻下处于MⅠ和MⅡ核分裂相的酵母细胞比例,描绘突变酵母菌株减数分裂整体进程,并对特定时刻酵母细胞进行Mei4-HA、Rad51和Zip1免疫荧光染色,明确突变对酵母减数分裂DSB产生及联会过程的影响,证实突变位点的有害性。利用CRISPR/Cas9技术构建p.Gln 356*位点基因敲入小鼠,测试雌鼠生育力并进行纯合和杂合小鼠生殖表型观察,明确p.Gln 356*突变对卵巢储备功能的影响。结合突变酵母表型,进行减数分裂前期卵母细胞染色体铺片和γ-H2AX、RPA、RAD51、MEI4、REC114和SYCP1荧光染色,观察突变对卵母细胞减数分裂DSB形成、联会的影响,同时对胚胎期18.5天卵母细胞中HORMAD1介导的联会检查点通路进行荧光共染验证,并通过转录组测序证实突变对卵母细胞关键基因表达情况的影响,揭示突变影响卵巢储备的作用机制。结果共发现2例POI患者分别携带MEI4(NM_001282136:c.15delA,p.Lys5Asnfs*4;c.1066C>T,p.Gln 356*)杂合突变。免疫共沉淀结果显示,突变p.Lys5Asnfs*4影响MEI4与REC114结合,p.Gln 356*并不影响蛋白与REC114的结合,但p.Gln356*同源突变酵母菌株(Mei4 p.Ile386*)的孢子存活率为0%,减数分裂整体进程提前约1h。同时,突变型酵母细胞中的Mei4-HA和Rad51信号数目显著下降,且缺乏Zip1呈线状分布的细胞,证实突变p.Gln356*影响酵母减数分裂DSB形成和联会。点突变小鼠生殖表型观察显示,Mei4 Arg356*/Arg356*雌鼠完全不育,卵母细胞在胚胎期18.5天即出现大量凋亡,出生之后原始卵泡快速耗竭,25日龄时卵巢中已无原始卵泡,2月龄小鼠卵泡几近耗竭。10月龄杂合雌鼠卵巢中原始卵泡数目减少,提Z-VAD-FMK供应商示MEI4对卵巢功能的维持具有剂量效应。对卵母细胞进行染色体铺片和荧光染色发现,Mei4 Arg356*/Arg356*卵母细胞早期γ-H2AX、RPA、RAD51、MEI4、REC114水平显著下epigenetics (MeSH)降,SYCP1信号分布异常,出现与突变酵母一致的DSB形成缺陷、联会障碍表型。且由于联会障碍,Mei4Arg356*/Arg356*卵母细胞染色体未联会区域HORMAD1解离异常,γ-H2AX、p-ATR等信号分子表达增强,部分区域的转录活动受到抑制,发生未配对染色体沉默(meiotic silencing of unsynapsed chromatin,MSUC)。卵母细胞转录组测序结果证实Mei4 Arg356*/Arg356*卵母细胞中一些负责细胞生存、发育的关键基因表达沉默,同时细胞内凋亡相关基因的表达出现上调。结论本研究首次在POI患者中发现MEI4杂合致病突变,证实了突变对卵巢储备功能的影响,阐明了卵母细胞DSB形成基因功能缺陷引发联会障碍,激活细胞中HORMAD1联会检查点通路,最终导致卵母细胞过度凋亡和POI发生的作用机制。全文小结本研究在POI患者中发现PRDM9、ANKRD31和MEI4基因致病突变,丰富了POI致病基因谱,揭示了减数分裂DSB形成基因在卵巢储备建立和功能维持中的重要作用,为POI患者的精准诊疗提供理论依据。