研究背景Protein Tyrosine Kinase抑制剂:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的死亡率位于所有恶性肿瘤第三位。因其高侵袭性和高转移率,绝大多数患者失去手术治疗机会,全身治疗是晚期不可手术的肝细胞癌患者首选治疗方案。分子靶向治疗,如仑伐替尼,是晚期HCC的一线治疗药物。尽管仑伐替尼延长了无法手术切除的中晚期HCC患者的中位总生存期,但其长期生存仍然不能使广大患者满意,靶向治疗所产生的固有的和获得性耐药显著限制了分子靶向药物在HCC中的疗效,因此现阶段肝细胞癌治疗形势依然严峻。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激广泛参与了肿瘤侵袭和转移过程,并诱导HCC细胞对于多种化疗药物及分子靶向药的治疗抵抗,但内质网应激诱导的耐药机制涉及多种信号通路,目前尚无法完全解释。目前认为阻断内质网应激下游调控通路及作用靶点可能是治疗内质网应激相关耐药的有效策略。因此,探索内质网应激在肝癌中的相关靶基因可以为分子靶向药的治疗抵抗提供新的研究方向和理论基础。目的:寻找内质网应激在肝癌中发挥促癌作用的关键靶基因,为内质网应激相关的分子靶向药物耐药探寻新的治疗靶点。方法:(1)通过分析肝细胞癌内质网应激模型细胞与对照细胞的RNA测序、CHIP测序、ATAC测序数据集,将差异表达基因取交集,寻找内质网应激下游关键靶基因。利用Western Blot,q RT-PCR和免疫荧光技术验证关键基因ARHGEF2的m RNA和蛋白水平是否受内质网应激调控。(2)利用Jaspar数据库预测ARHGEF2的上游转录因子,并设计3个可能的启动子结合位点,采用双荧光素酶实验明确转录因子ZNF263与ARHGEF2的结合位点。利用靶向ZNF263的小干扰RNA和过表达质粒转染HCC细胞,采用Western BlJNJ-42756493核磁ot和q RT-PCR技术验证ZNF263对ARHGEF2的调控作用。(3)采用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC),Western Blot和q RT-PCR技术检测ARHGEF2在肝癌和癌旁组织中的表达,结合临床病理资料分析ARHGEF2与临床分期、组织学分级和预后的相关性。利用TCGA数据库中的公共数据验证ARHGEF2与临床病理特征的相关性。(4)利用慢病毒技术在HCC细胞系中构建ARHGEF2稳定干扰和ARHGEF2稳定过表达细胞系。通过CCK-8技术、克隆形成实验、裸鼠成瘤实验检测ARHGEF2对肝癌细胞体内外增殖的作用;通过HUVEC细胞微管形成实验、Transwell、划痕实验和鸡胚绒毛尿囊膜(Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)实验检测ARHGEF2在体内外血管形成中的作用。(5)利用CCK-8技术、克隆形成和流式细胞凋亡术检测ARHGEF2在仑伐替尼治疗敏感性中的作用。通过HUVEC细胞的微管形成实验、CAM实验、CCK-8技术、克隆形成实验验证内质网应激在诱导血管形成和仑伐替尼治疗敏感性中的作用;敲低ARHGEF2后,利用CCK-8技术、克隆形成、流式细胞凋亡术和血管形成相关实验检测内质网应激诱导的血管形成和仑伐替尼治疗抵抗是否被逆转。利用荷瘤小鼠给药实验检测仑伐替尼联合ARHGEF2干扰是否使异种肿瘤移植模型获益。(6)行转录组测序,寻找ARHGEF2作用的关键下游靶基因。通过Western Blot和q RT-PCR技术验证下游靶基因EDN1是否受ZNF263/ARHGEF2调控。利用小干扰RNA技术在HCC细胞中敲低EDN1表达,通过HUVEC细胞微管形成实验、Transwell、划痕实验和CAM实验检测EDN1在体内外血管形成中的作用。在过表达ARHGEF2的HCC细胞中敲低EDN1,利用血管形成相关实验检测ARHGEF2诱导的血管形成能力是否由EDN1介导。结果:(1)内质网应激上调肝癌细胞中ARHGEF2的表达。将RNA测序、CHIP测序、ATAC测序数据集的差异表达基因进行汇总交集,发现了包括ARHGEF2、TRIB3、NMNAT2、HKDC1和CREB5在内的5个差异基因,结合测序结果并对差异基因进行验证,筛选得到上调的基因ARHGEF2作为内质网应激下游的研究目标。Western Blot,q RT-PCR和免疫荧光实验均发现,内质网应激诱导剂TM上调了ARHGEF2蛋白和m RNA表达水平,内质网应激抑制剂4-PBA则下调了ARHGEF2蛋白和m RNA表达。(2)内质网应激通过转录因子ZNF263转录激活ARHGEF2。分别在肝癌细胞系Hep G2和Hep3B中干扰ZNF263表达。Western Blot和q RT-PCR结果发现,ZNF263干扰下调了ARHGEF2蛋白和m RNA表达水平。相反,在肝癌细胞系Huh7和MHCC97H中过表达ZNF263,则上调ARHGEF2表达水平。使用Jaspar数据库确定了三个ZNF263可能与启动子结合的位点,双荧光素酶实验表明R3(-355/-335,AGGGGAGGGAAAAAGGGAGGG)可能是ZNF263的结合位点。(3)ARHGEF2在肝癌中高表达并与不良预后有关。对138例患者的肝癌及癌旁组织芯片进行IHC染色,结果显示,相较于癌旁组织,ARHGEF2在肝癌组织中高表达且其表达与临床分期、组织学分级和预后不良相关。Western Blot和q RT-PCR结果同样提示ARHGEF2在肝细胞癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且TCGA数据库的分析结果也进一步验证了这一结论。(4)ARHGEF2促进肝细胞癌体内及体外增殖。构建ARHGEF2稳定干扰及过表达细胞株后,CCK-8实验、克隆形成实验和裸鼠成瘤实验表明干扰ARHGEF2能够明显抑制HCC细胞体内外增殖,过表达ARHGEF2则显著增强了HCC细胞增殖及成瘤能力。(5)ARHGEF2是促进血管生成的重要因子。构建ARHGEF2稳定干扰及过表达细胞株后,收集细胞条件培养基行Transwell和划痕实验,结果表明干扰ARHGEF2抑制了血管内皮细胞的迁移和侵袭能力,过表达ARHGEF2则显著促进血管内皮细胞迁移和侵袭。微管形成实验和CAM实验表明,ARHGEF2在体外促进微管形成,在体内增加新生血管反应。(6)ARHGEF2参与仑伐替尼治疗敏感性。CCK-8和流式细胞术提示,在Hep G2细胞中干扰ARHGEF2,肝癌细胞对仑伐替尼敏感性升高,可获取更好的抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。反之,在MHCC97H细胞系中过表达ARHGEF2,肝癌细胞对仑伐替尼敏感性降低,仑伐替尼促进细胞凋亡的作用明显减弱。微管形成实验和CAM实验表明,内质网应激诱导体内外新生血管的形成;CCK-8技术和克隆形成实验验证了内质网应激参与仑伐替尼耐药。而在敲低ARHGEF2后,内质网应激诱导的血管形成和仑伐替尼治疗抵抗性被部分抑制。荷瘤小鼠给药实验表明,与对照组和仑伐替尼单药组相比,仑伐替尼联合ARHGEF2干扰microRNA biogenesis可以获得更好的抑制体内肿瘤的作用。(7)EDN1是ARHGEF2下游效应因子。成功构建ARHGEF2干扰细胞株后,将ARHGEF2干扰细胞和对照Hep G2细胞行转录组测序,共鉴定出272个差异基因m RNA水平的变化,其中EDN1是ARHGEF2参与的多条通路发挥作用的共同基因。利用Western Blot和q RT-PCR技术在HCC细胞中进行验证,发现内质网应激/ZNF263/ARHGEF2通路上调了HCC细胞中EDN1的蛋白及m RNA表达水平。(8)ARHGEF2通过EDN1发挥促血管形成作用。利用小干扰RNA技术在HCC细胞中敲低EDN1后,收集细胞条件培养基行CAM实验、微管实验、Transwell实验和划痕实验,结果表明,干扰EDN1可显著抑制HUVEC细胞微管成管、迁徙及侵袭能力,并抑制新生血管形成。在ARHGEF2过表达细胞系中干扰EDN1则逆转了ARHGEF2促进血管形成的作用。结论:(1)在HCC细胞中,ARHGEF2是内质网应激下游重要靶基因。(2)内质网应激通过ZNF263在转录水平上调控ARHGEF2的表达。(3)ARHGEF2在肝癌中高表达,并与临床分期、组织学分级及不良预后相关。(4)ARHGEF2体内和体外促进HCC细胞的增殖、肿瘤生长以及血管形成。(5)EDN1是ZNF263/ARHGEF2通路的下游靶基因,ARHGEF2调控血管形成的过程通过EDN1介导。(6)ARHGEF2干扰HCC细胞对仑伐替尼的敏感性;ARHGEF2缺失逆转了内质网应激诱导的血管形成和HCC细胞对仑伐替尼的凋亡抵抗。