目的:六价铬[Cr(Ⅵ)]是一种环境重金属污染物,能影响雄性生殖功能,对睾丸造成损伤,但是其具体机制尚未阐明。支持细胞是Cr(Ⅵ)导致睾丸损伤的靶细胞之一。本研究通过建立Cr(Ⅵ)致小鼠睾丸支持细胞TM4细胞系损伤模型,观察Cr(Ⅵ)对TM4细胞的毒性作用,并进一步探讨铁死亡、自噬、铁自噬在Cr(Ⅵ)致TM4细胞损伤中的作用及其机制。方法:睾丸支持细胞TM4细胞系培养和传代,CCK-8法检测1.25-40μM Cr(Ⅵ)作用12、24和48 h对细胞活力的影响;透射电镜观察细胞超微结构变化;DCFHDA探针检测细胞ROS水平;试剂盒检测细胞内GSH和MDimmunity effectA含量的变化以及总铁含量的变化;Western blot法检测血睾屏障相关蛋白CX43、ZO-1,铁死亡相关蛋白FPN1、Tf R1、SLC7A11、GPX4,自噬相关蛋白LC3B、P62、BECLIN1,和铁自噬相关蛋白NCOA4、FTH1的表达。TM4细胞给予5μM Cr(Ⅵ)染毒同时给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1,检测细胞活力、ROS水平和铁死亡相关蛋白的表达。TM4细胞给予5μM Cr(Ⅵ)染毒同时给予自噬抑制剂3-MA,检测细胞活力、ROS水平以及自噬、铁自噬和铁死亡相关蛋白的表达。siRNA沉默NCOA4基因后,检测siRNA沉默效率,给予5μM Cr(Ⅵ)染毒,检测ROS水平以及铁死亡和铁自噬相关蛋白的表达。结果:1.Cr(Ⅵ)对TM4细胞的损伤作用:TM4细胞存活率随Cr(Ⅵ)染毒时间和剂量的增加而下降。电镜结果显示对照组细胞结构正常而Cr(Ⅵ)染毒组出现自噬小体和自噬溶酶体,线粒体膜密度增高、嵴减少。Western blot法结果显示,血睾屏障相关蛋白ZO-1和CX43蛋白表达随着染毒剂量增加而下降,染毒组显著低于对照组(P<0.05)。2.Cr(Ⅵ)诱导TM4细胞铁死亡的发生:试剂盒检测结果表明TM4细胞内GSH含量随Cr(Ⅵ)染毒剂量增高而下降,MDA含量、ROS水平、总铁含量随Cr(Ⅵ)染毒剂量增高而上升;与对照组相比,5μM和10μM组有显著性差异(P<0.05)。铁稳态和铁死亡相关蛋白Tf R1表达随着染毒剂量增加而升高,5μM和10μM组显著高于对照组(P<0.Telaglenastat核磁05);FPN1和GPX4蛋白表达随着染毒剂量增加而降低,染毒组显著低于对照组(P<0.05);SLC7A11蛋白表达仅在10μΜ组显著低于对照组(P<0.05)。3.抑制铁死亡可减轻Cr(Ⅵ)诱导的TM4细胞损伤:与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,铁死亡抑制剂Fer-1与Cr(Ⅵ)联合处理后细胞活力显著升高(P<0.05),CDK抑制剂ROS水平显著降低(P<0.05),GPX4蛋白表达显著升高(P<0.05),Tf R1蛋白表达显著降低(P<0.05)。4.铁自噬在Cr(Ⅵ)暴露对TM4细胞损伤中的作用:自噬相关蛋白LC3B II/I比值和BECLIN1表达随着染毒剂量增加而上升,5μM和10μM组显著高于对照组(P<0.05);P62蛋白表达随着染毒剂量增加而下降,5μM和10μM组显著低于对照组(P<0.05)铁蛋白吞噬的相关蛋白NCOA4蛋白表达随着染毒剂量增加而上升。与对照组相比,5μM、10μM组蛋白表达有显著性差异(P<0.05));而FTH1蛋白表达随着染毒剂量增加而下降,与对照组相比,5μM、10μM组蛋白表达有显著性差异(P<0.05)。5.抑制自噬可减轻Cr(Ⅵ)致TM4细胞铁死亡的发生:与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,自噬抑制剂3-MA与Cr(Ⅵ)联合处理后细胞活力显著上升(P<0.05),ROS水平显著降低(P<0.05),NCOA4蛋白表达以及LC3B II/I蛋白比值显著下降(P<0.05),而P62、GPX4和FTH1蛋白表达显著升高(P<0.05)。6.NCOA4介导的铁自噬在Cr(Ⅵ)暴露TM4细胞铁死亡中的作用:NCOA4基因沉默后,与Cr(Ⅵ)单独染毒组相比,ROS水平显著降低(P<0.05),NCOA4和Tf R1蛋白表达显著降低(P<0.05),而FTH1和GPX4蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:1.Cr(Ⅵ)能够造成TM4细胞损伤。2.Cr(Ⅵ)通过铁死亡导致TM4细胞损伤;铁死亡抑制剂Fer-1处理后,减少Cr(Ⅵ)致TM4细胞铁死亡的发生。3.Cr(Ⅵ)通过铁自噬介导的铁死亡导致TM4细胞损伤。3-MA以及siRNA沉默NCOA4基因抑制铁自噬后,减少Cr(Ⅵ)致TM4细胞铁自噬介导的铁死亡的发生。