偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)是可以高效降解利用木质纤维素的重要白腐菌。碳代谢阻遏(Carbon catabolite repression,CCR)是生物体优先利用简单碳源的机制,在自然界广泛存在。已有研究表明,在酵母和丝状子囊菌中碳代谢抑制子CRE1具有抑制综纤维素酶基因表达的作用,CRE2具有去泛素化作用,与CRE3形成复合体,可稳定被泛素标记的CRE1。在白腐菌中CRE2与CRE1的关系与功能还少有研究。为了探究偏肿革裥菌中CCR的机理,深刻理解在白腐菌中的碳代谢过程与木材白腐机制,本研究在对Lg-cre2和Lg-cre3基因进MCC950生产商行克隆、生物信息学分析的基础上,采用分子对接分析两者的结合作用;以同源重组法获得ΔLg-cre2突变体菌株,验证Lg-CRE2的功能,旨在揭示白腐菌中的CCR机制。主要研究结果如下:1、Lg-cre2、Lg-cre3基因克隆及生信分析。克隆得到Lg-cre2基因全长3036 bp,Lgcre3全长2721 bp;Lg-CRE2蛋白序列分析比对到C19肽酶,具有去泛素化酶作用,其中存在DH-Ⅱ、DH-Ⅲ、DH-Ⅳ、DH-Ⅴ四个位于α螺旋结构处的高度保守的基序;LgCRE3蛋白结构预测到5个重复的WD40结构单元;分子对接模拟显示Lg-CRE2和LgCRE3可形成稳定的复合体。2、偏肿革裥菌薄壁菌丝经酶解法获得原生质体。1.5%溶壁酶处理1 h时菌丝顶端少量出现球状原生质体,直径大于菌丝宽度;处理2 h时菌丝碎片化,原生质体数量增加,呈串状排列;处理3 h时原生质体数量明显增加,状态圆润饱满,散乱分布。3、ΔLg-cre2突变体菌株载体构建及转化。同源重组法构建p KOV-Δcre2::hpt敲除质粒,PEG介导转化法得到11个转化子,PCR结果表明4、6、10、11号转化子为阳性敲除转化子,根据在抗性平板上的生长情况,最终选定4号转化子为ΔLg-cre2突变体菌株,用于进行后续试验。4、ΔLg-cre2突变体菌株的生长表型研究。普通LNAS平板上ΔLg-cre2突变体菌株较野生型菌株在萌发初期生长速率略慢,但差异并不显著;ΔLg-cre2突变体菌株菌落白色丝绒状或棉毛状质地,菌落边缘呈辐射状、菌丝密度较稀疏、缺少絮状气生菌丝;微观结构下为有隔菌丝,具有锁状联合结构Genetic burden analysis和少量厚垣孢子,菌丝顶端分枝少且单一。5、不同碳源处理下生长表型及纤维素酶活研究。在不同碳SB203580 IC50源平板上,ΔLg-cre2突变体菌株对可溶性淀粉及木质素的降解能力显著增强;在液体培养基发酵液中ΔLg-cre2突变体菌株分泌蛋白的含量增加、纤维素酶活性提高,但并不显著;在复杂碳源处理下,野生型和突变株分泌蛋白含量及纤维素酶活性都显著提高。6、Lg-CRE2对关键基因的表达调控功能研究。不同碳源处理下敲除株Lg-cre2表达量较野生型下降,Lg-cre1和Lg-cre3基因表达量升高,纤维素酶基因表达量也显著提高。比较简单碳源和复杂碳源间的关键基因表达情况,除Lg-cre2外复杂碳源可诱导关键基因表达的显著上升。综上所述,偏肿革裥菌的Lg-cre2基因通过影响CRE调控因子的表达情况来影响纤维素酶基因的表达。ΔLg-cre2突变体菌株在对机体生长表型影响较小的同时显著提高了对木质纤维素的降解能力,具有去碳代谢阻遏作用。