血管性痴呆(vascular dementia,VD)是继阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)之后导致痴呆的第二大类型。据世界卫生组织报告,全世界约有6000万人患有VD,预计到2050年上升到1.6亿。不幸的是,迄今为止,VD的发病机制尚不完全明确,并且缺乏有效的治疗药物。因此,深入研究VD的发病机制,寻找有效的VD防治药物具有重大的社会和经济效益。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)属于I型细胞因子超家族的糖蛋白,能够与红细胞表面受体结合,促进细胞的增殖、分化和成熟。EPO除有促Alisertib溶解度进红细胞生成作用外,还具有广泛的生物学活性,特别是在神经系统的作用越来越受到重视。目前研究发现,EPO及其受体能在多种哺乳动物的中枢神经细胞、胶质细胞、血管内皮细胞等多个部位表达。当机体受到缺氧、创伤或其他应激性刺激时,内源性EPO及其受体的表达上调,通过多种作用机制发挥神经保护作用。在中枢神经系统中,海马是学习和记忆的主要脑区,也是缺血缺氧易损区。目前的证据显示,当大脑受到缺血缺氧损伤时,海马区神经元显示出明显的病理学改变,细胞凋亡及自噬被过度激活,最终导致该区神经元的死亡。在中枢神经系统中,EPO通过与EPO受体(erythropoietin receptor,EPOR)结合发挥神经保护作用,激活EPOR的磷酸化表达,活化的EPOR进一步激活下游的Janus激酶/转录激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)等信号通路,其中PI3K/Akt在细胞存活信号转导中发挥重要作用。但是到目前为止,EPO能否通过PI3K/Akt信号通路调节海马神经元凋亡和自噬,从而改善VD大鼠的学习和记忆能力,有待于实验的进一步证实。本研究选取雄性Wistar大鼠,采用双侧颈总动脉结扎术(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)建立VD大鼠模型,应用EPO连续干预4周,采用Morris水迷宫评价大鼠的学习和记忆能力改变状况,尼氏染色观察海马神经元形态学改变,采用TUNEL染色观察处理对细胞凋亡影响,通过Western blot检测海马神经元蛋白表达和磷酸化,验证EPO是否通过激活PI3K/Akt信号转导通路抑制凋亡和自噬发挥神经保护作用,从而为应用EPO改善认知障碍提供理论依据。第一部分促红细胞生成素对血管性痴呆大鼠认知功能的影响目的:BCCAO法建立大鼠VD动物模型,EPO治疗4周,通过Morris水迷宫试验评估VD大鼠的记忆学习能力,观察EPO对VD大鼠的认知能力是否有改善。方法:1.清洁级成年雄性Wistar大鼠40只,随机分为三组,假手术组(Sham组,n=13)、模型组(Model组,n=13)、EPO处理组(EPO组,n=14)。2.假手术组(Sham组)仅剥离出双侧颈总动脉不结扎,给予等量生理盐水灌胃,连续4周,作为其余两组的对照。3.模型组(Model组)双侧颈总动脉结扎术后给予等量生理盐水灌胃,连续4周。4.EPO处理组(EPO组)双侧颈总动脉结扎术后给予5000UI/kg EPO灌胃,连续4周。5.给药结束后第二天对大鼠进行Morris水迷宫实验,该实验包含两部分内容:第一部分是定位航行实验(place navigation test),连续训练5天,记录三组大鼠的逃逸潜伏期(escape latency),用来评估大鼠的空间学习能力。第二部分是空间探索实验(spatial probe test),在实验的第6天,移去隐藏的平台,记录大鼠在120s内在原站台象限停留的时间和穿越原站台频次,用来评估大鼠的空间记忆能力。结果:1.随着训练天数增加,三组大鼠逃逸潜伏期逐渐缩短。2.在定位航行实验的第1天,三组大鼠的逃逸潜伏期无明显差异;实验的第2天,与Sham组相比,Model组的逃逸潜伏期明显延长(P<0.05),实验的第3-5天,EPO组和Sham组逃逸潜伏期较Model组显著缩短(P<0.05)。3.在空间探索实验中,相较于Model组,Sham组和EPO组的大鼠在原目标象限停留的时间显著延长,并且穿越平台次数明显增多(P<0.05)。结论:1.采用BCCAO的方法建立的VD大鼠模型在一定程度上与临床VD的发病过程相似,是理想的VD动物实验模型。2.EPO能够有效改善VD的大鼠因慢性低灌注导致的认知功能障碍。第二部分促红细胞生成素对VD大鼠海马的组织形态学影响目的:观察各组血管性痴呆大鼠海马神经元的组织形态学改变,以评估EPO的神经细胞保护作用。方法:1.水迷宫测试结束后,将大鼠麻醉,灌注后固定处死,石蜡包埋脑组织切片。2.切片进行尼氏染色,光镜下观察海马区锥体细胞的形态学变化。结果:1.100倍镜下结果:Sham组海马区锥体细胞数量较多,细胞排列紧密;Model组海马区锥体细胞排列松散,神经元数量减少;EPO组大鼠海马区锥体细胞数量和密度较Model组明显多而密。2.400倍镜下结果:Sham组海马区锥体细胞排列紧密,大小一致,结构完整,胞质染色较深,形状规则饱满,核仁清晰;Model组海马区锥体细胞排列松散紊乱,大小不一,胞质染色较浅,细胞核固缩深染,部分细胞核仁消失呈空泡状;EPO组大鼠海马区锥体细胞较Model组明显好转。结论:1.术后Model组的大鼠海马区锥体细胞出现明显的组织病理学改变。2.经过4周EPO治疗后,EPO组大鼠认知功能改善的同时,海马区神经元损伤得到一定程度的减轻。第三部分促红细胞生成素对海马组织细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的调控目的:检测海马组织细胞中PI3K/Akt信号通路中蛋白的磷酸化、凋亡、自噬相关蛋白的表达水平以及自噬流的变化,探索EPO对海马神经元PI3K/Akt信号通路以及对凋亡、自噬相关蛋白的影响。方法:1.Western blot检测血管性痴呆大鼠海马组织和体外培养神经元细胞中EPOR、PI3K、Akt、CREB等蛋白的磷酸化水平、凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-caspase 9以及自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1和ATG5的表达水平。2.TUNEL法可在单细胞水平检测细胞凋亡,凋亡的细胞核呈黄绿色,可以在荧光显微镜下观察到黄绿色的凋亡细胞。TUNEL染色阳性细胞数与凋亡程度成正比。在荧光显微镜下随机选择5个视野计数TUNEL阳性细胞和总细胞数,计算凋亡指数(apoptosis index,AI)(各区域阳性细胞数/细胞总数)。3.Western blot检测血管性痴呆大鼠海马细胞和体外培养神经元细胞中LC3II/LC3I和P62的表达。结果:1.EPO对血管性痴呆大鼠海马区神经元EPOR、Akt、PI3K、CREB蛋白磷酸化水平的影响:与Model组相比,Sham组大鼠EPOR、Akt、PI3K、CREB蛋白磷酸化水平较低(P<0.05),差异有统计学意义。提示海马区在缺氧条件下会刺激海马神经元EPOR高表达,这将有助于提高大鼠对环境改变的适应性;在外源性EPO介入的情况下,EPOR、Akt、PI3K、CREB蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05),两组的差异有统计学意义,提示外源性EPO能弥补内源性分泌的不足,与高表达的EPOR结合后使信号通路蛋白EPOR、PI3K、Akt、CREB进一步活化。2.EPO对血管性痴呆大鼠海马区神经元凋亡和自噬相关蛋白表达的影响:与Sham组相比,Model组大鼠Bax、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9、LC3B、Beclin 1、ATG5蛋白表达水平升高(P<0.05),差异有统计学意义。提示低灌注条件下血管性痴呆大鼠海马区神经元存在明显的凋亡和自噬;在外源性EPO介入的情况下,Bax、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase 9、LC3B、Beclin 1、ATG5蛋白表达水平较Model组显著降低(P<0.05),两组的差异有统计学意义,提示EPO可显著抑制海马区神经元在慢性低灌注条件下自噬过度激活和细胞凋亡。3.体外实验中对照组与对照组加EPO相比,对照组加EPO处理后EPOR磷酸化水平升高(P<0.05),而PI3K、Akt的磷酸化水平,凋亡和自噬相关蛋白Bax、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9、LC3B、Beclin1、ATG5表达水平无显著差异,提示外源性EPO可刺激海马神经元EPOR磷酸化,但是生理作用可能与神经元保护无关;对照组加抑制剂与对照组加EPO和抑制剂相比,Bax、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9、LC3B、Beclin 1、ATG5蛋白表达水平和PI3K、Akt磷酸化水平无显著差异,而EPOR的磷酸化水平升高,趋势与对照加抑制剂组相同,提示体内存在基础性的自噬和凋亡,且不受外源性EPO的影响;氧糖剥夺情况下,加入外源性EPO,EPOR、PI3K、Akt磷酸化水平显著升高,而凋亡和自噬相关蛋白Bax、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9、LC3B、Beclin 1、ATG5表达水平下降,差异有统计学意义,提示缺氧条件下,外源性EPO可以增强EPOR受体的磷酸化水平并进一步激活下游的PI3K/Akt信号通路来调控凋亡和自噬;氧糖剥夺加抑制剂情况下,加入外源性EPO,EPOR的磷酸化水平升高,而Bax、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9、LC3B、Beclin 1、ATG5蛋白表达和PI3K、Akt磷酸化水平无显著差异,进一步证实EPO通过激活下游的PI3K/Akt信号通路发挥作用。4.TUNEL实验结果:与Model组相比,Sham组凋亡阳性细胞几乎不可见,EPO处理组在显微镜下观察到少量绿色的阳性凋亡细胞数。Sham组和EPO处理组在显微镜下观察到着色的凋亡细胞比例明显降低。提示EPO具有抑制细胞凋亡作用。5.自噬流检测结果:体内实验结果显示,与Model组相比,Sham组和EPO组的LC3II/LC3I比值降低,且P62蛋白表达升高,差异有统计学意义。体外结果显示,与低氧组相比,EPO干预后,LC3II/LC3I比值降低,且P62蛋白表达升高,差异有统计学意义;但是加入抑制剂或者同时加入EPO和抑制剂后,LC3II/LC3I比值和P62蛋白表达基本不变。结论:1.经过4周EPO治疗后,海马神Biomass exploitation经元的凋亡和自噬被抑制,EPO可增加慢性低灌注条件下海马神经元的生存能力,可能机制是通过上调EPOR的磷酸化水平以及激活PI3K/Akt信号通路抑制缺氧诱导的海马神经元过度凋亡和自噬,从而有利于海马神经元在应激刺激后的存活。2.TUNEL法检测细胞凋亡进一步证实了EPO的神经保护作用。第四部分促红细胞生成素在血管性认知障碍患者中的差异性研究目的:研究EPO在血管性认知障碍和正常人的差异性,进一步为EPO治疗认知功能障碍提供临床依据。方法:选取自2022年1月至2023年1月河北省人民医院神经内科住院患者42例为研究对象,其中血管性认知障碍患者21例,非血管性认知障碍21例。血管性认知障碍诊断依据《2019年中国血管性认知障碍诊治指南》。非血管性认知障碍患者MRI未显示结构性、出血性或炎症性病变证据以及其他神经或精神疾病证据。采用回顾性研究血管性痴呆与各因素的相关性。结果:1.两组研究对象的性别、年龄、血压、血糖和脑脊液生化结果无统计学差异。2.在血管性认知功能障碍患者中,患者脑脊液EPO浓度与年龄显著相关,而与血清中的EPO浓度无显著相关;血清中的EPO浓度与年龄显著相关。结论:1.血管性认知障碍患者脑脊液中EPO浓度与血清浓度无显著相关。2.血管JNJ-42756493溶解度性认知障碍患者脑脊液中的EPO的表达存在与年龄正相关。