低温损伤是指人体因为受到寒冷刺激产生的机体损伤,主要表现为冻伤。我国地理环境复杂,寒区分布广泛,寒区居民、科考人员与部队官兵在生活、科研、训练和执勤中极易发生冻伤,由于地理环境因素限制,冻伤往往会造成截肢、休克、死亡等不良后果,严重影响机体生命安全。依据受损深度,冻伤可分为4度,Ⅰ度冻伤仅涉及表皮,为浅层冻伤,症状轻且易完全恢复;临床上更为常见且难以治愈的是Ⅱ-Ⅳ度冻伤,主要累及真皮层,损伤重且易反复发作,治疗效果一直难以达到预期。成纤维细胞不仅是皮肤真皮层的主要细胞类型,更是参与皮肤伤口愈合的主要修复细胞,自身的细胞增殖、迁移和活化与损伤修复息息相关,其功能的正常与否直接影响了皮肤损伤的修复进程。尽管已有研究表明,皮肤低温损伤具有区别于其他皮肤创伤的独特病理过程,但成纤维细胞在低温损伤的修复过程中如何发挥作用目前还没有研究证实。因此,以成纤维细胞为实验材料,深入研究皮肤低温损伤的病理机制十分必要,具有重要的科学意义和社会意义。本研究采用L929成纤维细胞作为实验材料,通过控制温度和干预时间以建立低温损伤成纤维细胞模型;采用MTT法分析了低温刺激对L929成纤维细胞损伤程度的影响;使用Brd U法检测了低温对L929成纤维细胞增殖能力的影响;采用细胞黏附实验、迁移实验和酶联免疫吸附实验评价了低温对L929成纤维细胞运动能力的影响;应用Hoechst33342染色、Caspase-3活性测定以及Annexin V-PI双染法,检测低温Marine biomaterials对L929成纤维细胞凋亡的影响;运用流式细胞术检测PS-341细胞培养低温对L929成纤维细胞周期分布的影响;通过Masson染色与羟脯氨酸含量测定,评价低温干预对L929成纤维细胞胶原合成能力的影响;利用流式细胞术、SOD活性测定和MDA含量检测,判断低温对L929成纤Bemcentinib溶解度维细胞氧化应激水平的影响;最后,我们运用Western blot对PI3K/Akt通路和ERK通路关键蛋白质分子进行了定量检测,以期初步阐明低温干预对L929成纤维细胞造成损伤的内在分子生物学机制。实验结果显示,L929成纤维细胞培养72 h后,34℃、30℃和26℃干预的L929成纤维细胞增殖能力、黏附能力和迁移能力均明显受到抑制(P<0.05),34℃、30℃和26℃低温组MMP-9表达量明显下降(P<0.05),30℃和26℃低温组MMP-2表达量显著降低(P<0.05);形态学结果表明,随着温度降低,低温组L929成纤维细胞体积变小,正常细胞形态丧失,出现细胞皱缩和变圆的现象;流式细胞仪检测的细胞周期分布结果显示,L929成纤维细胞周期因低温的刺激明显阻滞在了G2/M期(P<0.05);Hoechst33342染色结果显示,低温组细胞可观察到大量凋亡小体、染色质浓缩和边集现象,26℃低温组部分细胞发生染色质碎裂并散在分布;Caspase-3活性测定和Annexin V-PI双染法数据显示,与37℃对照组相比,随着温度降低L929成纤维细胞的Caspase-3活性显著增加(P<0.05),流式细胞术检测到细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例明显升高(P<0.05);ROS水平检测、SOD活性测定和MDA含量检测的实验数据显示,与37℃对照组相比,26℃低温组ROS水平上升,MDA含量明显增加(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),30℃和34℃低温组的ROS水平和MDA含量没有明显变化,34℃低温组的SOD活性显著升高(P<0.05);通过分析HYP检测和Masson染色的实验结果,我们发现不同程度低温对L929成纤维细胞胶原合成能力造成了一定抑制作用。Western blot实验数据显示,低温导致L929成纤维细胞的PI3K/Akt通路和ERK通路关键分子的表达水平发生了抑制,上调了Cyclin B1、P53、Bax和Caspase-3的表达水平。综上所述,低温对L929成纤维细胞不仅具有显著的增殖抑制作用、细胞周期阻滞和诱导凋亡的作用,还明显抑制了L929成纤维细胞的运动能力和胶原合成能力,其可能的机制是低温异常调控了PI3K/Akt通路和ERK通路关键分子的表达。本研究的发现为阐明冻伤发生的分子生物学机制提供了一定的实验室数据,也为皮肤冻伤治疗药物的研发提供了潜在靶点。