研究目的探讨优化新生脉散方治疗慢性心力衰竭(心衰)有效及可能影响心肌纤维化的MAPK信号通路机制。研究方法1优化新生脉散方治疗心衰及心肌纤维化潜在靶点的网络药理学探讨从HERB数据库获取优化新生脉散方所含活性成分,再通过Discovery Studio软件以Lipinski五倍率法则筛选有效成分;从HERB、SEA和Swiss Target Prediction数据库获取有效成分靶蛋白;从HERB、OMIM、Gene Cards、Pharm Gkb、TTD和Drug Bank数据库分别获取心衰和心肌纤维化的疾病蛋白,与有效成分靶蛋白取交集;利用Rx644.0.2软件对交集蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,获取优化新生脉散方治疗心衰及心肌纤维化的信号通路;利用STRING数据库和Cytoscape-v3.9.0软件筛选疾病治疗关键信号通路的核心蛋白;对有效成分与核心蛋白进行拓扑分析,利用Auto Dock Vina对两者进行分子对接,计算结合能,再通过Py MOLWin.exe和Ligplot可视化展现。2优化新生脉散方对心衰大鼠心肌纤维化及关键信号通路影响的实验观察根据网络药理学所得关键信号通路及核心蛋白进行实验探索,将90只SD雄性大鼠适应性喂养1周后随机分出空白组10只、假手术组10只和造模手术组70只;通过结扎冠状动脉左前降支构建心衰大鼠模型,12周后采用超声心动图测定心功能进行大鼠成模鉴定,从成模大鼠中随机选取40只,按每组8只随机分入模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组和卡托普利组,空白组和假手术组各随机选取8只。灌胃4周后,记录各组大鼠游泳力竭时间,超声心动图检测心功能和心室结构,脏器系数检测心肺变化,HE、Masson、天狼星红染色病理切片观察心肌形态学变化,ELISA和生化检测血清心衰标志物和信号通路激活因子,免疫组化检测信号通路核心指标阳性表达量,Western Blot检测信号通路蛋白Cardiac histopathology活性与表达、肌成纤维细胞标志物蛋白表达,RT-PCR检测信号通路终末效应分子和肌成纤维细胞标志物的m RNA表达。研究结果1网络药理学提示GO功能富集分析表明,优化新生脉散方可利用有效成分对细胞膜和细胞质中的蛋白分子进行特异性药物反应,干预生长因子与受体结合、GPCR与配体结合、GPCR蛋白活性、RTK蛋白活性、丝氨酸/苏氨酸激酶活性等,改善心肌各类细胞的缺氧状态和钙离子稳态,降低细胞间质胶原含量;KEGG富集分析表明,MAPK信号通路与优化新生脉散方抗心衰及心肌纤维化关系最为密切;筛选MAPK信号通路核心蛋白、拓扑分析有效成分与核心蛋白关系及分子对接得出,优化新生脉散方主要通过异鼠李素、槲皮素、山奈酚、丹参酮ⅡA等380种有效成分,靶向调控MAPK信号通路的ACE、CTGF、VEGF、TGFβ等23个核心蛋白。2实验研究结果2.1大鼠死亡及成模情况完成造模手术后,空白组大鼠未发生死亡,假手术组大鼠死亡1只,造模手术组大鼠死亡15只。首次超声结果显示,43只大鼠LVEF<50%。2.2干预前各组大鼠心功能空白组与假手术组大鼠各项心功能参数未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠LVEF、LVFS、IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs显著降低,LVEDV、LVESV、LVIDd、LVID显著升高(P<0.05或P<0.01)。各给药组与模型组大鼠各项心功能参数未见统计学差异(P>0.05)。2.3各组大鼠游泳力竭时间空白组与假手术组大鼠游泳力竭时间未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠游泳力竭时间显著缩短(P<0.01)。各给药组大鼠游泳力竭时间显著多于模型组(P<0.05或P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,卡托普利组大鼠游泳力竭时间在中药中、高剂量组之间,各组间存在统计学差异(P<0.01)。2.4干预后各组大鼠心功能空白组与假手术组大鼠各项心功能参数未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠LVEF、LVFS、IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs显著降低,LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs显著升高(P<0.01)。与模型组相比,各给药组大鼠LVEF、LVFS、IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs显著升高,LVEDV、LVESV、LVIDd、LVIDs显著降低(P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.05或P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.5各组大鼠脏器系数空白组与假手术组大鼠HWI、LVMI、PI、HW/TL、LVW/TL、LW/TL未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠各项脏器系数显著增大(P<0.01)。各给药组大鼠各项脏器系数显著低于模型组(P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.05或P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.6各组大鼠血清心衰标志物空白组与假手术组大鼠NT-Pro BNP、CKMB、s ST2、c Tn、AST、LDH未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠各项血清心衰标志物显著升高(P<0.01)。各给药组大鼠各项血清心衰标志物显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.05或P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.7各组大鼠心脏组织病理学观察2.7.1 HE染色空白组和假手术组大鼠心肌纤维排列致密、结构完整、大小均匀、细胞核居中,间质仅少量淡红色胶原纤维,细胞数未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱、肥大、边界模糊、大量死亡,胶原纤维蓄积,细胞数显著低于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠心肌损伤减轻,心肌纤维排列规则、死亡减少、细胞核较清晰,纤维化减轻,细胞数均显著多于模型组(P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.7.2 Masson染色空白组和假手术组大鼠心肌横纹肌清晰,心肌纤维排列规则,间质仅少量蓝色胶原纤维,CVF未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌横纹肌消失,心肌纤维排列紊乱、大量坏死,细胞间质充满大量蓝色胶原纤维,CVF显著增大(P<0.01)。各给药组大鼠心肌胶原沉积显著减少,CVF均显著小于模型组(P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.7.3天狼星红染色空白组和假手术组大鼠心肌纤维致密、排列整齐,间质仅少量I/Ⅲ型胶原纤维,I/Ⅲ型胶原纤维占比未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌I/Ⅲ型胶原纤维明显粗大、增多、分布不均、排列无序,交错成网状,I/Ⅲ型胶原纤维占比显著大于假手术组(P<0.01)CHIR-99021作用。各给药组大鼠心肌I/Ⅲ型胶原纤维明显变细、减少,I/Ⅲ型胶原纤维占比均显著小于模型组(P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.8各组大鼠血清MAPK信号通路激活因子空白组和假手术组大鼠AGE、AngⅡ、VEGF、CTGF、TGFβ未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠血清MAPK信号通路激活因子显著高于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠血清MAPK信号通路激活因子均显著低于模型组(P<selleck激酶抑制剂0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.05或P<0.01),中药中剂量组AGE、VEGF、TGFβ与卡托普利组相仿(P>0.05),中药高剂量组AGE、VEGF、CTGF、TGFβ低于卡托普利组(P<0.05或P<0.01),但AngⅡ高于卡托普利组(P<0.01)。2.9各组大鼠心肌MAPK信号通路核心指标阳性表达量空白组和假手术组大鼠心肌p-ERK1/2和p-JNK1/2的阳性表达量未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠p-ERK1/2和p-JNK1/2的阳性表达量显著多于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠心肌p-ERK1/2和p-JNK1/2的阳性表达量均显著低于模型组(P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.10各组大鼠心肌MAPK信号通路和肌成纤维细胞标志物的蛋白活性及表达2.10.1各组大鼠心肌ERK1/2分支的蛋白活性及表达比较空白组与假手术组大鼠心肌p-RAS/RAS、p-RAF/RAF、p-MEK1/2/MEK1/2、pERK1/2/ERK1/2、p-ELK/ELK及c-Fos的蛋白表达未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌ERK1/2分支的蛋白活性及表达显著高于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠心肌ERK1/2分支的蛋白活性及表达显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.10.2各组大鼠心肌JNK1/2分支的蛋白活性及表达比较空白组与假手术组大鼠心肌p-IRAK4/IRAK4、p-IRAK1/IRAK1、p-TAK1/TAK1、p-MKK4/MKK4、p-MKK7/MKK7、p-JNK1/2/JNK1/2及MD2、TLR4、My D88、c-Jun的蛋白表达未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌JNK1/2分支的蛋白活性及表达显著高于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠心肌JNK1/2分支的蛋白活性及表达显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药中剂量组大鼠心肌MD2、TLR4蛋白表达与卡托普利组相仿(P>0.05),中药高剂量组大鼠心肌MD2、TLR4蛋白表达低于卡托普利组(P<0.05或P<0.01),对其余JNK1/2分支蛋白活性及表达的调控与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.10.3各组大鼠心肌MAPK信号通路终末效应分子的蛋白表达比较空白组与假手术组大鼠心肌p-c-Fos、p-c-Jun、LOX、Cyclin D1、COLⅠ、COLⅢ的蛋白表达未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌MAPK信号通路终末效应分子的蛋白表达显著高于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠心肌MAPK信号通路终末效应分子蛋白表达显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.05或P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.10.4各组大鼠心肌肌成纤维细胞标志物的蛋白表达比较空白组与假手术组大鼠心肌α-SMA的蛋白表达未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌α-SMA的蛋白表达显著高于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠心肌α-SMA的蛋白表达显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.05或P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.11各组大鼠心肌MAPK信号通路终末效应分子和肌成纤维细胞标志物的m RNA表达比较2.11.1各组大鼠心肌MAPK信号通路终末效应分子的m RNA表达比较空白组与假手术组大鼠心肌c-Fos、c-Jun、Cyclin D1、LOX、COLⅠ、COLⅢ的m RNA表达未见统计学差异(P>0.05),模型组大鼠心肌MAPK信号通路终末效应分子的m RNA表达显著高于假手术组(P<0.01)。各给药组大鼠心肌MAPK信号通路终末效应分子的m RNA表达显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。2.11.2各组大鼠心肌肌成纤维细胞标志物的m RNA表达比较空白组与假手术组大鼠心肌α-SMA的m RNA表达未见统计学差异(P>0.05),而模型组显著增加(P<0.01)。各给药组大鼠心肌α-SMA的m RNA表达均显著低于模型组(P<0.01),且中药作用呈剂量相关性,组间存在统计学差异(P<0.01),中药高剂量组与卡托普利组相仿(P>0.05)。研究结论1.优化新生脉散方可剂量依赖性地改善冠状动脉结扎诱导心衰大鼠模型的心功能,减轻心肌纤维化病理改变,延缓心室重构。2.优化新生脉散方可能是通过抑制MAPK信号通路ERK1/2、JNK1/2分支的激活和信号传导,以及靶向调控c-Fos和c-Jun蛋白降解,减少Cyclin D1、LOX等促心肌成纤维细胞增殖、分化和COLⅠ/Ⅲ成熟相关基因的转录、翻译,进而改善I/Ⅲ型胶原纤维沉积,起到抗心衰及心肌纤维化的作用。