L-苏氨酸是人类和动物营养的一种必需氨基酸,广泛应用于食品、医药和饲料等领域,全球市场规模超70万吨/年。L-苏氨酸是猪饲料的第二限制性氨基酸,家禽饲料的第三限制性氨基酸,主要用途是作为饲料添加剂。目前工业上是通过大肠杆菌(Escherichia coli)发酵生产L-苏氨酸。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)作为谷氨酸和L-赖氨酸等氨基酸工业生产底盘,具有生物安全、环境适应性强等优势,是L-苏氨酸高效生产的潜力菌株。然而,目前谷氨酸棒杆菌生产L-苏氨酸容易积累大量其它氨基酸副产物,导致L-苏氨酸水平仍然有限。已有研究阻断或弱化副产物合成途径的策略,会导致菌株为营养缺陷型或仅能部分降低副产物积累。本研究从野生型谷氨酸棒杆菌出发,首先通过解除L-苏氨酸合成途径关键酶的反馈抑制以及增强关键基因的表达,实现了L-苏氨酸及副产物的合成;其次通过增强2种副产物合成途径的反馈抑制,大genetic renal disease幅降低副产物的积累;最后过表达L-苏氨酸外排蛋白和高丝氨酸激酶,进一步提高L-苏氨酸产量并降低副产物积累。主要研究内容和结果如下:(1)L-苏氨酸合成途径的改造:在野生型谷氨酸棒杆菌中,针对lysC(编码天冬氨酸激酶)基因和hom(编码高丝氨酸脱氢酶)基因,分别引入已报道的T311I和G378E点突变解除反馈抑制,L-苏氨酸产量达到0.27 g/L。分别采用强启动子P_(pyc-20)和P_(gpm A-16)增强lys C~(T311I)-asd和hom~(G378E)-thr B操纵子的表达,L-苏氨酸产量提高至2.33 g/L,同时副产物L-赖氨酸、L-异亮氨酸、甘氨酸和L-高丝氨酸产量也达到0Erastin说明书.47-0.96 g/L。(2)L-苏氨酸发酵副产物合成途径的改造:采用异源强反馈抑制关键酶基因替换谷氨酸棒杆菌内源基因,实现副产物合成控制,同时不导致菌株营养缺陷型。通过来源于肺炎球菌的二氢吡啶二羧酸合成酶基因Spdap A替换,增强L-赖氨酸合成途径的反馈抑制,孔板发酵显示不再积累L-赖氨酸;通过来源于大肠杆菌的苏氨酸脱水酶基因EcilvA替换,增强L-异亮氨酸合成途径的反馈抑制,L-异亮氨酸产量也可从0.42 g/L降低至0.03 g/L。改造后菌株的孔板发酵,不需要额外添加任何营养物质,L-苏氨酸或前体L-高丝氨酸产量可小幅提高。(3)L-苏氨酸外排蛋白和高丝氨酸激酶的过表达:分别过表达不同来源的L-苏氨酸外排蛋白,包括谷氨酸棒杆菌内源的Thr E和Ser E以及大肠杆菌来源的Rht C。结果显示Rht C过表达效果最显著,L-苏氨酸产量从2.98 g/L提高至9.07g/L,提高了2.04倍;然而其导致前体L-高丝氨酸产量也从0.71 g/L提高至2.10g/L。为了减少L-高丝氨酸的积累,进LY294002一步过表达了高丝氨酸激酶基因thr B,孔板发酵显示L-高丝氨酸产量可降低至0.15 g/L。从头构建的工程菌Zcgl T11在5 L罐进行发酵罐生产评价,L-苏氨酸产量可达67.63 g/L,糖酸转化率0.21 g/g,生产强度为1.21 g/L/h;发酵过程无L-赖氨酸积累,发酵终点L-异亮氨酸和甘氨酸积累量约1 g/L,L-高丝氨酸产量为4.58 g/L。本研究通过L-苏氨酸和副产物氨基酸合成途径的反馈抑制重构及表达调控,从头构建了非营养缺陷型谷氨酸棒杆菌L-苏氨酸生产菌,多种副产物氨基酸积累量显著降低,L-苏氨酸产量和生产强度均高于谷氨酸棒杆菌中目前报道的最高水平。本研究开发的副产物控制策略,为解决谷氨酸棒杆菌生产L-苏氨酸副产物问题提供了一个新思路,也可以为构建其它氨基酸生产菌株提供借鉴。