研究背景:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是2型糖尿病中最为常见的一种微血管并发症。传统认为DN以肾小球的病变为主要特征,但越来越多的研究表明,肾小球损伤可能不是DN进展的决定性因素,而肾小管的损害在DN早期即存在,且与蛋白尿、肾功能恶化和肾脏的远期预后密切相关。因此,肾小管结构和功能的异常是DN发生和进展的关键环节,积极探索其损伤的发生机制和保护措施对于DN的防治具有重要意义。人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)因免疫原性低、再生能力强和高旁分泌潜能等优点已被公认为移植首选的MSCs,但hUCMSCs治疗DN的研究尚处于初级阶段,具体作用机制仍有待深入探索。我们课题组前期研究发现,hUCMSCs可通过激活核因子-E2相关因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)改善肾脏的氧化应激,而氧化应激贯穿于铁死亡的始终,且铁死亡发生过程中的铁代谢、脂质代谢和谷胱甘肽的合成皆由Nrf2调控,所以靶向Nrf2来调控铁死亡可能是hUCMSCs治疗肾脏疾病的新机制。然而,hUCMSCs、Nrf2以及铁死亡的关系在DN领域仍缺乏研究。因此,本课题主要探索hUCMSCs能否通过激活Nrf2信号通路来调控2型糖尿病肾脏的铁死亡,进而改善DN,为此,我们进行了以下研究。第一部分HUCMSCs对2型糖尿病肾脏的保护作用目的:明确hUCMSCs对2型糖尿病小鼠肾脏和高糖高脂刺激的人肾小管上皮细胞的保护作用。方法:1.体内实验,雄性野生型(Wild-type,WT)C57BL/6J小鼠随机划分为4组:对照组(Ctrl)、人脐带间充质干细胞组(MSC)、糖尿病组(DM)、糖尿病+人脐带间充质干细胞组(DM/MSC)。DM组和DM/MSC组小鼠经高脂饮食联合链脲佐菌素来诱导2型糖尿病模型,模型成功后约3个月,糖尿病小鼠的尿白蛋白/肌酐(Urinary albumin-to-creatinine ratio,UACR)明显升高,根据本课题组前期的研究基础,MSC组和DM/MSC组小鼠分别给予hUCMSCs 1*10~6个细胞/只尾静脉注射治疗,7天/次,共注射3次,末次治疗7天后取材,用于各项指标的检测。首先,比较各组小鼠的血液和尿液的生理、化学指标;通过PAS、甲苯胺蓝染色和透射电子显微镜观察小鼠肾脏形态学变化;通过蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测肾小管损伤标志物即肾损伤分子-1(Kidney injury molecule-1,KIM-1)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)的蛋白水平。2.体外实验,我们应用高浓度葡萄糖和棕榈酸钠(Palmitate)共同刺激人肾小管上皮细胞来构建细胞损伤的体外模型。实验分4组:对照组(Ctrl)、人脐带间充质干细胞组(MSC)、高糖高脂组(HG/P)、高糖高脂+人脐带间充质干细胞组(HG/P/MSC)。然后,利用Transwell小室将LEE011价格MSC组和HG/P/MSC组的肾小管上皮细胞与hUCMSCs建立共培养体系。采用CCK-8和WB法分别检测肾小管上皮细胞的细胞活力及肾小管损伤因子的蛋白水平。结果:1.体内实验,与Ctrl组比较,DM组小鼠体重下降,血糖、肾脏肥大指数、UACR、血肌酐和血尿素氮明显升高(P<0.05);hUCMSCs的治疗可改善小鼠的血糖、体重、UACR和血肌酐水平(P<0.05),但对肾脏肥大指数及血尿素氮的影响不显著(P>0.05)。2.体内实验,与Ctrl组比较,DM组小鼠的肾小球肥大、系膜基质增生、上皮细胞足突融合、肾小球和肾小管基底膜增厚、肾小管上皮细胞脱落和小管间质胶原纤维沉积,而DM/MSC组小鼠的上述病理表现较DM组明显减轻;相比于Ctrl组,DM组小鼠肾小管损伤因子KIM-1和NGAL蛋白水平明显升高(P<0.0001),而DM/MSC组较DM组明显降低(P<0.001)。3.体外实验,CCK-8和WB结果显示,30 m M的葡萄糖作用24 h联合300μM的Palmitate作用6 h,可成功构建高糖高脂刺激的人肾小管上皮细胞损伤模型,2*10~5个/ml的hUCMSCs是最适宜的共培养剂量。与Ctrl组对比,HG/P组肾小管上皮细胞KIM-1和NGAL蛋白表达增加(P<0.001),但HG/P/MSC组相比于HG/P组,KIM-1和NGAL的蛋白水平下降(P<0.001)。结论:1.HUCMSCs体内给药可减轻2型糖尿病小鼠肾脏的组织学损伤和功能异常;2.HUCMSCs体外干预可缓解高糖高脂刺激的人肾小管上皮细胞的损伤。第二部分HUCMSCs通过激活Nrf2调控2型糖尿病肾脏铁死亡的机制研究目的:明确hUCMSCs能够通过调节铁代谢、脂质过氧化和抗氧化途径来调控2型糖尿病肾脏的铁死亡,且可能是通过激活Nrf2信号通路实现的。方法:1.利用第一部分的体内和体外模型,通过透射电镜分别观察小鼠的肾小管和高糖高脂刺激的人肾小管上皮细胞的线粒体形态学变化,经WB、普鲁士蓝染色、二价铁离子荧光探针、免疫组化和免疫荧光等技术评估铁死亡途径中铁代谢、脂质过氧化和抗氧化通路上相关指标的表达变化。2.体内和体外实验,通过WB检测糖尿病小鼠肾脏和高糖高脂刺激的人肾小管上皮细胞中Nrf2及其下游因子HO1和NQO1的蛋白表达变化,探讨hUCMSCs是否通过激活Nrf2信号通路来调控铁死亡。体内实验,提取小鼠肾组织中的核蛋白和浆蛋白,通过WB测核蛋白和浆蛋白中Nrf2的表达水平;体外实验,采用激光共聚焦显微镜观察Nrf2蛋白在人肾小管上皮细胞中的表达定位。结果:1.体内实验,与Ctrl组相比,DM组小鼠肾小管的线粒体萎缩、膜密度增加和少量嵴断裂,但与DM组比较,DM/MSC组小鼠的线粒体体积、嵴结构和膜密度明显改善;评估铁代谢指标,相较于Ctrl组,DM组小鼠肾脏总铁含量增加(P<0.01),FTH1蛋白水平下降(P<0.01),TFR1蛋白水平升高(P<0.0001),而DM/MSC组对比DM组,其铁含量降低,FTH1蛋白升高,TFR1蛋白下降(P<0.05);评估脂质过氧化指标,对比Ctrl组,DM组MDA含量、4HNE和ACSL4的蛋白水平升高(P<0.05),但与DM组比较,hUCMSCs可显著降低小鼠的MDA含量、4HNE和ACSL4蛋白水平(P<0.05);检测抗氧化能力,与Ctrl组比较,DM组小鼠的GPX4和x CT的蛋白表达降低(P<0.01),而DM/MSC组相较于DM组,二者的蛋白表达升高(P<0.05),且GPX4蛋白主要表达于肾小管。2.体外实验,与Ctrl组对比,HG/P组细胞的线粒体萎缩、膜密度增加、线粒体外膜破裂,可见嵴断裂,但相比于HG/P组,HG/P/MSC组细胞的线粒体嵴和外膜结构完整,膜密度恢复;检测铁代谢指标,对比Ctrl组,HG/P组Fe~(2+)荧光强度明显增加,FTH1蛋白下降,TFR1蛋白升高(P<0.0001),而与HG/P组比较,HG/P/MSC组Fe~(2+)荧光强度减弱,FTH1蛋白水平升高,TFR1蛋白水平下降(P<0.01);评估脂质过氧化产物,HG/P组对比Ctrl组,其ROS荧光亮度明显增强,4HNE和ACSL4蛋白水平升高(P<0.01),但在HG/P/MSC组,ROS荧光强度、4HNE和ACSL4蛋白水平较HG/P组明显降低(P<0.05);评估抗氧化能力,与Ctrl组比较,HG/P组GPX4和x CT蛋白水平下降(P<0.0001),而HG/P/MSC组相比于HG/P组,GPX4和x CT蛋白水平升高(P<0.001)。3.体内实验,与Ctrl组相比,DM组小鼠的Nrf2、HO1和NQO1蛋白水平明显下降,而DM/MSC组相比于DM组,三者蛋白水平显著升高(P<0.05);体外实验,HG/P组细胞相比于Ctrl组,其Nrf2、HO1和NQO1蛋白表达明显降低,而与HG/P组比较,HG/P/MSC组三者的蛋白含量显著升高(P<0.05)。体内实验,DM/MSC组肾脏确认细节核Nrf2蛋白(n Nrf2)含量相比于Ctrl组和DM组明显增多(P<0.01),而胞浆Nrf2蛋白(systems geneticsc Nrf2)在各组间差异不明显(P>0.05);体外实验,HG/P组Nrf2蛋白主要表达于细胞浆中,而HG/P/MSC组相比于HG/P组Nrf2蛋白增多,并且主要集聚在细胞核内。结论:1.HUCMSCs在体内、外可通过调控铁死亡途径来改善2型糖尿病的肾脏损伤;2.HUCMSCs可能通过调控Nrf2表达,激活Nrf2通路来调控铁死亡。第三部分Nrf2在hUCMSCs调控铁死亡改善2型糖尿病肾病中的关键作用目的:明确Nrf2在hUCMSCs调控铁死亡和改善2型糖尿病肾病中的重要作用。方法:1.体内实验,应用和上述WT小鼠同背景的Nrf2基因敲低(Nrf2-knockdown,Nrf2~(-/-))的雄鼠构建2型糖尿病动物模型,实验分5组:野生型对照组(WT Ctrl)、Nrf2~(-/-)对照组(Nrf2~(-/-)Ctrl)、人脐带间充质干细胞组(Nrf2~(-/-)MSC)、糖尿病组(Nrf2~(-/-)DM)、糖尿病+人脐带间充质干细胞组(Nrf2~(-/-)DM/MSC)。糖尿病模型的构建,hUCMSCs的治疗剂量和时间等与第一部分WT小鼠相一致。比较各组Nrf2~(-/-)小鼠的生理、生化学指标;通过PAS、甲苯胺蓝染色和透射电镜观察小鼠肾脏形态学的变化;通过WB检测肾小管损伤因子的蛋白表达;经透射电镜、WB、免疫组化技术评估铁死亡途径中相关指标的表达水平;通过WB评估Nrf2~(-/-)小鼠肾脏Nrf2通路上蛋白的表达情况。2.体外实验,对人肾小管上皮细胞进行Nrf2 siRNA的转染,实验分8组,即对照组(Ctrl)、人脐带间充质干细胞组(MSC)、高糖高脂组(HG/P)、高糖高脂+人脐带间充质干细胞组(HG/P/MSC)、对照+Nrf2 siRNA组(s-Ctrl)、人脐带间充质干细胞+Nrf2 siRNA组(s-MSC)、高糖高脂+Nrf2 siRNA组(s-HG/P)及高糖高脂+人脐带间充质干细胞+Nrf2 siRNA组(s-HG/P/MSC),经WB检测铁死亡通路上关键指标ACSL4、FTH1和GPX4蛋白的表达变化。结果:1.体内实验,WT Ctrl组与Nrf2~(-/-)Ctrl组小鼠的血糖、体重、UACR和血肌酐水平无统计学差异(P>0.05)。但Nrf2~(-/-)DM组相比于Nrf2~(-/-)Ctrl组,其小鼠体重下降,血糖、UACR和血肌酐明显升高(P均<0.05),经hUCMSCs治疗后,相比于Nrf2~(-/-)DM组,Nrf2~(-/-)DM/MSC组小鼠的上述指标明显改善(P<0.05)。但对比WT和Nrf2~(-/-)的糖尿病小鼠,hUCMSCs使前者的体重、血糖、UACR和血肌酐分别改善12%、22.8%、24.5%和36%,而使后者的体重、血糖、UACR和血肌酐分别改善11.6%、18%、14.3%和12%。观察肾脏形态学变化发现,WT Ctrl组和Nrf2~(-/-)Ctrl组小鼠的肾脏形态无明显异常,但Nrf2基因的敲低加重了糖尿病的肾脏损伤,Nrf2~(-/-)DM组小鼠可见明显的肾小球基底膜增厚、足突融合,系膜细胞和基质显著增生,肾小管上皮细胞脱落,管腔扩大及肾小管间质胶原纤维沉积;而Nrf2~(-/-)DM/MSC组与Nrf2~(-/-)DM组比较,小鼠的肾小球系膜细胞和系膜基质明显减少,肾小球基底膜的厚度有降低的趋势,但差别无统计学意义(P>0.05),仍可见肾小管上皮细胞脱落及小管间质胶原纤维沉积。检测肾小管损伤蛋白发现,相比于Nrf2~(-/-)Ctrl组,Nrf2~(-/-)DM组的KIM-1和NGAL蛋白水平明显升高(P<0.0001),而经hUCMSCs的治疗可下调KIM-1的蛋白表达(P<0.01),但对NGAL的蛋白水平无显著影响(P>0.05)。2.体内实验,WT Ctrl组与Nrf2~(-/-)Ctrl组线粒体形态完整,但Nrf2~(-/-)DM组相较于Nrf2~(-/-)Ctrl组,可见线粒体萎缩、线粒体膜密度增加及线粒体外膜破裂,但Nrf2~(-/-)DM/MSC组和Nrf2~(-/-)DM组比较,其线粒体膜密度略有改善,但仍可见明显的线粒体萎缩和线粒体外膜破裂;WT Ctrl组与Nrf2~(-/-)Ctrl组的总铁含量、TFR1和FTH1蛋白水平无明显差别,但相比于Nrf2~(-/-)Ctrl组,Nrf2~(-/-)DM组的铁含量和TFR1蛋白水平升高(P<0.01),FTH1蛋白水平降低(P<0.0001),但Nrf2~(-/-)DM/MSC组对比Nrf2~(-/-)DM组,上述铁代谢指标无明显改善(P>0.05);MDA含量、4HNE和ACSL4蛋白水平在WT Ctrl和Nrf2~(-/-)Ctrl组无明显差异,但在Nrf2~(-/-)DM组三者含量升高(P<0.01),且hUCMSCs治疗后,相比于Nrf2~(-/-)DM组,Nrf2~(-/-)DM/MSC组MDA含量,4HNE和ACSL4蛋白水平未见明显下降(P>0.05);与WT Ctrl组相比,Nrf2~(-/-)Ctrl组及Nrf2~(-/-)DM组的GPX4蛋白表达明显下调(P<0.0001),而Nrf2~(-/-)DM/MSC组与Nrf2~(-/-)DM组的GPX4蛋白水平无显著差异(P>0.05)。此外,Nrf2~(-/-)DM组与Nrf2~(-/-)Ctrl组比较,x CT蛋白水平下降(P<0.0001),但Nrf2~(-/-)DM/MSC组相比于Nrf2~(-/-)DM组的x CT蛋白水平无明显变化(P>0.05)。与WT Ctrl组相比,Nrf2~(-/-)Ctrl组和Nrf2~(-/-)DM组的Nrf2、HO1和NQO1蛋白表达明显被抑制,经hUCMSCs干预后,Nrf2、HO1和NQO1的蛋白仍低表达(P>0.05)。3.体外实验:Nrf2 siRNA转染后,与Ctrl组相比,s-Ctrl组的ACSL4蛋白含量升高,但差别无统计学意义(P>0.05),但相较于s-Ctrl组,s-HG/P组ACSL4蛋白表达明显升高(P<0.001),而在s-HG/P/MSC组未见明显下降(P>0.05);与s-Ctrl组对比,s-HG/P组FTH1蛋白下调(P<0.0001),而s-HG/P/MSC组与s-HG/P组FTH1蛋白含量无统计学差异(P>0.05);与Ctrl组相比,Nrf2 siRNA转染后,各组GPX4蛋白表达明显被抑制,且hUCMSCs无法上调GPX4的蛋白水平(P>0.05)。结论:1.Nrf2基因的敲低减弱了hUCMSCs对DN的保护作用,也加重了2型糖尿病的肾脏损伤;2.Nrf2基因的缺失明显减弱了hUCMSCs对铁死亡的抑制作用,Nrf2对hUCMSCs调控铁死亡具有关键作用。综上,我们得出全文结论:1.HUCMSCs可以改善2型糖尿病小鼠肾脏的组织学损伤和功能异常;2.HUCMSCs可以通过旁分泌作用减轻高糖高脂刺激的人肾小管上皮细胞的损害;3.HUCMSCs在体内、外可通过调节铁代谢、抑制脂质过氧化和改善抗氧化能力来抑制2型糖尿病肾脏的铁死亡;4.HUCMSCs可能通过调控Nrf2表达,激活Nrf2信号通路来调控铁死亡;5.Nrf2基因的敲低不仅减弱了hUCMSCs对DN的保护作用,也加重了2型糖尿病的肾脏损伤;6.Nrf2基因的敲低基本消除了hUCMSCs对铁死亡的抑制作用,Nrf2对hUCMSCs调控铁死亡具有关键作用。