目的:癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,影响着全球近5000万人。迄今为止,三分之一的患者癫痫发作无法通过药物控制。目前用于临床抗癫痫药物仅针对症状而不改变疾病的进程,事实上癫痫的病理生理学受到许多因素的影响,开发延缓癫痫进程的药物可能对临床治疗产生积极影响。由于天然植物提取物具有多重药理效果且副作用较小,越来越多的研究开始关注其在抵抗癫痫带来的损伤中所具有的效果。癫痫的发病机制尚不清楚,但是氧化应激在癫痫发生发展过程中所起到的重要作用已被证实。癫痫发作可导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,积累的活性氧可诱导神经元进一步氧化损伤。近年来,许多研究致力于从减少活性氧的角度治疗癫痫,并验证了抗氧化的治疗的显著效果。人参皂苷是人参C.A.Mey的有效成分,分为多个亚型,如Rb1、Rb2、Rc、Rh2和Rg3,已被证实具有神经保护、心血管保护、免疫调节作用和抗菌活性。Rh2对急性暴露于三甲基锡(TMT)诱导的神经损伤可以发挥抗氧化作用,从而保护神经元,但它是否对癫痫有治疗效果仍然未知。本研究旨在体内体外癫痫模型中探究人参皂苷Rh2是否能抵抗癫痫样活动诱导的氧化应激损伤,并进一步研究这种抗氧化作用的内在机制,这为寻找天然药物辅助治疗癫痫和人参皂苷Rh2在抗氧化方面的研究提供了新的思路。方法:1、采用不同浓度人参皂苷Rh2预处理SH-SY5Y细胞后,无Mg~(2+)培养3h诱导癫痫样活动以构建癫痫细胞模型。MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测凋亡程度,荧光显微镜观察ROS和Rh123荧光强度并半定量分析测量活性氧生成水平和线粒体膜电位变化,以探究人参皂苷Rh2对体外癫痫模型中SH-SY5Y细胞的保护作用。2、在GEO数据库中选取符合条件的癫痫组织测序数据GSE31718,R语言分析筛选差异基因。在线数据库预测人参皂苷Rh2可能的靶基因,并与之前筛选出的差异基因取交集。检测交集中的部分基因在组织和细胞及用药后模型的表达情况,对这些基因的可能功能进行分析研究,随后构建人参皂苷Rh2与Fox O3a蛋白结合的模型,探究两者相互作用的可能机制。3、采用CO-IP实验,比对普通SH-SY5Y细胞与人参皂苷Rh2处理的SH-SY5Y细胞之间,普通SH-SY5Y细胞、无Mg~(2+)培养3h后的SH-SY5Y细胞和不同浓度人参皂苷Rh2预处理后无Mg~(2+)培养3h的SH-SY5Y细胞之间的Fox O3a乙酰化程度。提取普通和药物处理后的SH-SY5Y细胞,无Mg~(2+)培养3h后的普通SH-SY5Y细胞和人参皂苷Rh2预处理的SH-SY5Y细胞中FOXO3a-KEAP1-NRF2通路蛋白的表达情况。p Fox O3-luc质粒转染后的SH-SY5Y细胞也分为空白对照,无Mg~(2+)培养3h和不同浓度人参皂苷Rh2预处理后无Mg~(2+)培养3h三组,预处理结束后用双荧光素酶试剂盒检测三组细胞中Fox O3a转录活性的差异。4、通过质粒转染SH-SY5Y细胞,构建沉默和过表达Fox O3a的细胞系,WB实验检验转染效率,并验证Fox O3a对KEAP1-NRF2通路蛋白的调控作用。在正常SH-SY5Y细胞、sh FOXO3a的SH-SY5Y细胞、过表达FOXO3a的SH-SY5Y细胞中检测无Mg~(2+)培养3h后的线粒体膜电位和ROS生成水平。再以实验浓度人参皂苷Rh2预处理三种细胞24h后,无Mg~(2+)培养3h诱导癫痫细胞模型,对比组间线粒体膜电位和ROS生成水平。5、立体定向仪杏仁核颅内注射海人酸(KA)构建海人酸杏仁核点燃大鼠癫痫模型,通过预实验选定动物实验的合适药物浓度。将大鼠分为空白对照组、载体对照组、用药治疗组,Pulmonary infection异氟醚麻醉后,采用立体定向的方法向大鼠侧脑室注入实验用试剂。在三组大鼠中分别随机抽取2只,在注药结束后监测脑电,观察大鼠清醒后癫痫发作时的脑电图。其余大鼠在一周后处死,TUNEL染色检测大鼠海马神经元凋亡情况,DHE染色检测大鼠海马ROS累积情况,WB实验检测大鼠海马中FOXO3a-KEAP1-NRF2通CP-456773试剂路蛋白的表达情况,并检测大鼠海马匀浆和大鼠血浆中的TAC水平及大鼠海马提取物中GSH/GSSG水平。结果:1、人参皂苷Rh2能减轻癫痫引起的SH-SY5Y细胞活力下降、ROS生成增加和线粒体去极化加重,减轻SH-SY5Y细胞在癫痫条件下所受氧化应激损伤。2、人参皂苷Rh2通过结合FOXO3a与CBP/p300的结合位点,降低了SH-SY5Y细胞中FOXO3a与CBP/p300的结合程度,从而减少FOXO3a的乙酰化水平,使得FOXO3a不能转入细胞核,失去转录活性最后被降解。3、在人类TLE患者病灶的脑组织和体外癫痫模型中,FOXO3a的RNA和蛋白水平与对照组相比表现出显著增加。4、人参皂苷Rh2通过影响FOXO3a的转录活性调节FOXO3a-Keap1-NRF2通路,增加重要的抗氧化酶NQO1的表达。5、过表达Fox O3a的SH-SY5Y细胞系在癫痫样活动中更易受到氧化应激损伤;敲减Fox O3a的SH-SY5Y细胞系表现出了一定的对癫痫样活动带来的氧化应激损伤的抵抗作用,但对人参皂苷Rh2治疗作用的反应较弱。6、给药人参皂苷Rh2可以减轻海人酸诱导的癫痫持续状态大鼠癫痫发作严重程度,减轻海马CA1区的神经细胞凋亡。7、人参皂苷Rh2增加了慢性癫痫大鼠海马和血浆中的TAC,并增加了慢性癫痫大鼠海马中的GSH水平。结论:1、FOXO3a在获得性癫痫患者的致痫灶组织、SH-SY5Y细胞构建的癫痫细胞模型和KA点燃大鼠癫痫模型海马组织中的表达明显增加。且FOXO3a的过表达将加重体外癫痫模型中SH-SY5Y细胞细胞的氧化损伤,反之敲减FOXO3a对此类损伤有一定的保护作用,说明了FOXO3a的高表达可能是加重癫痫患者神经元氧化应激损伤的重要因素。2、FOXO3a的过表达激活了NRF2负性调控因子KEAP1,降低了NRF2和NQO1的蛋白水平,这种关系部分解释了癫痫引起的内源性抗氧化防御的降低。确认细节3、人参皂苷Rh2在体内外癫痫模型中都表现出了明显的抗氧化应激神经保护作用。在体外,抑制癫痫样活性诱导的线粒体去极化、ROS产生和细胞死亡。在体内提高内源性GSH水平和总抗氧化能力,并能显著降低癫痫样活动诱导的海马神经元细胞死亡。4、人参皂苷Rh2的神经保护作用可能通过抑制FOXO3a乙酰化,降低FOXO3a转录活性,进而抑制FOXO3a-KEAP1-NRF2通路的激活,最终增加NRF2相关抗氧化酶的表达。