第一部分二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂阻止T-ALL细胞生长目的:急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)是白血病中难治、易复发、预后差的亚型之一。复发时,T-ALL病人对传统化疗药物易产生耐药性,寻找新型靶点药物是各国研究者关注的热点。嘧啶核苷酸是维持生命必需物质之一,已有研究证明从头嘧啶合成水平上升,促进急性髓系白血病、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞快速增殖、诱导耐药发生。靶向从头合成途径中的关键酶——二氢乳清酸脱氢酶(Dihydroorotate Dehydrogenase,DHODH)能抑制肿瘤细胞生长,但DHODH在T-ALL中的作用尚不清楚。方法:利用GEO、TARGET公共数据库,分析DHODH基因表达;利用加权基因共表达网络(WGCNA)分析DHODH基因共表达情况;收集T-ALL患者骨髓样本,利用RNA-Seq检测与验证DHODH在T-ALL表达;利用CCK8、流式细胞术、EDU等实验,探讨DHODH抑制剂特立氟胺(TeriflunomSCH727965 NMRide,TRF)对T-ALL细胞株、患者原代细胞及模型小鼠的作用;利用RNA-Seq及数据分析、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、RT-PCR、WB等初步探讨TRF抑制T-ALL生长的可能机制。结果:利用R2在线平台和GSE26713数据分析发现:与正常人相比,T-ALL患者DHODH mRNA表达增高。WGCNA分析发现:DHODH共表达基因富集在氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,OXPHOS)、ROS、三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)循环、嘧啶代谢和糖酵解等通路。T-ALL患者中,与DHODH~(low)组比,DHODH~(high)组患者初诊时WBC>100×10~9/L、混合谱系白血病(MLL)基因重排、诱导化疗后29天微小残留病(Minimal residual disease,MRD)阳性发生率增高。收集13例T-ALL患者及4例正常对照的骨髓细胞RNA-Seq结果显示DHODH在T-ALL呈现高表达。TRF作用于T-ALL细胞株MOLT4和JURKAT细胞,其半数细胞生长抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为21.42μM和19.00μM。TRF作用于T-ALL细胞(MOLT4和JURKAT),引起细胞凋亡增加、细胞周期中的S期细胞增多、ROS水平增高。TRF作用5例T-ALL原代细胞,发现4例被抑制。利用10μM TRF处理48h的MOLT4、JURKAT细胞接种NSG小鼠,结果发现:与对照组相比,TRF处理组小鼠骨髓肿瘤细胞数较少,脾脏体积较小、组织中肿瘤细胞浸润减少、生存时间较长。TRF处理前后的MOLT4细胞经RNA-Seq测序,GSEA数据分析显示两组差异基因基因富集在P53信号通路。数据进一步经韦恩及蛋白质相互作用网络(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)分析,寻找到可能的关键基因——B-细胞易位基因2(B-cell translocation gene 2,BTG2)。经RT-PCR及WB验证发现:与对照组相比,TRF处理MOLT4和JUadoptive cancer immunotherapyRKAT细胞后,P53和BTG2的mRNA和蛋白水平均升高。TRF作用于BTG2基因表达敲低的MOLT4和JURKAT细胞,发现其生长抑制率减低,周期阻滞作用减弱。结论:DHODH基因在T-ALL中高表达。DHODH抑制剂TRF抑制T-ALL细胞生长,可诱导T-ALL细胞凋亡、阻滞细胞周期,可能通过BTG2和P53信号起作用。第二部分柔红霉素(DNR)耐药T-ALL细胞株构建及鉴定目的:柔红霉素(Daunorubicin,DNR)是目前T-ALL一线诱导化疗方案VDLP(长春碱+柔红霉素+门冬酰胺酶+糖皮质激素)中的一种关键蒽环类药物,也是复发后再诱导治疗的常用药物。DNR作用强,副作用大,疗效呈剂量依赖性。若DNR出现耐药,其疗效减弱且毒副作用增加。T-ALL中对DNR耐药机制研究甚少,构建DNR耐药细胞模型有助于T-ALL耐药机制研究。方法:利用CCK8筛选DNR敏感的T-ALL细胞作为耐药诱导的目标细胞;利用逐步剂量递增连续暴露法构建DNR耐药T-ALL细胞模型;利用短串联重复序列(STR)技术和流式细胞术分别鉴定DNR耐药T-ALL细胞和功能验证;利用RNA-Seq测序与数据分析DNR耐药导致T-ALL细胞内的基因转录组改变。结果:经CCK8实验筛选出的T-ALL细胞中DNR敏感的细胞株包括MOLT4、JURKAT、CCRF-CEM细胞(分别命名为MOLT4-S、JURKAT-S、CCRF-CEM-S)作为耐药诱导目标细胞。利用逐步剂量递增连续暴露法成功诱导DNR耐药T-ALL细胞(分别命名为MOLT4-R、JURKAT-R、CCRF-CEM-R),其耐药指数[Resistance index,RI=IC50(R)/(S)]分别为MOLT4-R RI=566.9,JURKAT-R RI=152.0,CCRF-CEM-R RI=116.4。STR结果显示T-ALL的亲代细胞和耐药细胞两者匹配度≥80%。与DNR敏感T-ALL细胞相比,DNR耐药T-ALL细胞增殖能力增强、细胞周期无明显变化、免疫表型仅发现JURKATR CD1a+细胞减少、MOLT4-R CD5+细胞减少。耐药稳定性检测显示MOLT4-R RI=36.6,JURKAT-R RI=22.5,CCRF-CEM-R RI=10.6。RNA-Seq数据及GSEA提示DNR敏感与耐药T-ALL细胞间生物学过程、细胞定位、分子功能及信号通路等有较大差异,尤其是低氧、P53、凋亡和KRAS信号通路。结论:构建DNR持续耐药的T-ALL细胞。与DNR敏感T-ALL细胞比,DNR耐药T-ALL细胞增殖能力更强、基因转录组谱不一致。第三部分DHODH抑制剂提高DNR耐药T-ALL细胞的化疗敏感性目的:研究证明联合用药可克服肿瘤化疗耐药,本部分研究DHODH抑制剂TRF对DNR耐药T-ALL细胞的作用。方法:利用抗癌药物敏感性基因组学(Genomics of drug sensitivity in cancer,GDSC)数据库预测DHODH基因mRNA水平与药物敏感相关性;利用Calcusyn软件及Synergyfinder在线网站筛选TRF与DNR联合作用最佳药物浓度;利用CCK8、流式细胞术检测不同浓度TRF、TRF与DNR联合用药对DNR耐药T-ALL细胞(MOLT4-R和JURKAT-R)的细胞存活、细胞凋亡和周期的影响。结果:经GDSC数据库预测,发现T-ALL患者细胞中的DHODH表达与多柔比星、依托泊苷、甲氨蝶呤、长春碱、来那度胺、索拉菲尼等药物敏感性相关。CCK8结果显示,TRF抑制DNR耐药的两株TALL(MOLT4-R和JURKAT-R)细胞生长,IC50分别为72.89μM和93.98μM。流式细胞术结果显示TRF促进DNR耐药T-ALL细胞的凋亡,阻滞细胞周期在S期。CCK8检测发现DNR与TRF按1:100比例浓度作用于MOLT4-R和JURKAT-R细胞,经Calcusyn计算联合指数(combination index,CI)<1,提示两药具有协同作用。经Synergyfinder在线网站热图分析与协同模型模拟提示:MOLT4-R细胞在DNR 0.1μM联合TRF 10μM、DNR 0.2μM联合TRF 20μM作用时协同指数(Synergy score,SC)分别为32.71和34.03;JURKAT-R细胞在DNR 0.2μM联合TRF 20μM、DNR 0.4μM联合TRF 40μM作用时SC分别为28.18和34.48。MOLT4-R及JURKAT-R细胞在DNR 0.2μM与TRF 20μM联合作用时显示出比单药更强的生长抑PLX5622使用方法制与凋亡促进作用。结论:TRF抑制DNR耐药T-ALL细胞生长。一定浓度范围内DNR与TRF按比例浓度对DNR耐药T-ALL细胞具有协同作用。