研究背景主动脉瘤/夹层(Aortic aneurysm and dissection,AAD)是一类发病急、预后凶险和病死率高的疾病。主动脉瘤指主动脉呈不可逆性瘤样扩张(超过正常血管直径的50%)。主动脉夹层指主动脉腔内血液通过内膜破口渗入主动脉壁中层,使血管壁分为真假两腔。65岁以上的男性中,AAD的发病率高达9%。目前AAD主要通过手术干预,缺乏有效的药物治疗方案,因此急需寻找新的治疗靶点。既往研究发现,AAD的发病是多种内、外因素共同作用的结果,吸烟、高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、高龄均是其危险因素,其机制涉及遗传、环境和生物学因素多个方面。目前主要认为AAD有以下病理特点:中膜血管平滑肌细胞的功能障碍、炎症细胞的浸润、细胞外基质的降解,其中血管平滑肌细胞的功能障碍已被证实在疾病发生发展过程中发挥了关键作用。收缩型血管平滑肌细胞可维持血管张力,维持血管健康状态。然而,在病理条件下,收缩型平滑肌细胞可以去分化为一种分泌表型,通过分泌胞外囊泡、增殖和迁移来修复损伤,这一过程称为表型转换,并且已被证实是AAD的关键起始步骤。AAD患者早期发病隐匿,常无明显症状,如果不及时进行手术干预,死亡率高达90%以上。AAD发病机制不明,目前尚无有效措施延缓其主动脉扩张过程。研究AAD发病机制,寻找早期治疗靶点,对于延缓AAD早期进展,防止其破裂和减少手术几率具有重要意义。最新研究表明,作为血管第一道防线的内皮细胞(Endothelial cells,ECs)在AAD发生发展中发挥关键作用,其屏障功能改变可通过增加炎症细胞浸润和血管水肿进而促进AAD的发生发展。尽管目前研究已明确了内皮屏障破坏是AAD发生发展的重要原因,但在此病理过程中,屏障功能改变如何被调控还需更深层的研究。乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase2,ALDH2)是乙醛脱氢酶超家族成员之一,在19种同工酶中活性最强,是人体内酒精(乙醇)代谢通路和多种内外源性醛类物质代谢的关键酶之一。该酶分布广泛,除肝以外,还丰富表达于心脏、肾脏、肺、脑等多种组织,在心脑血管疾病、肿瘤及神经退行性疾病的发生发展中均具有重要的病理生理意义。ALDH2基因至少有5个单核苷酸多态。其中,位于第12外显子的Glu504Lys多态性位点(rs671)广泛存在于中、日、韩等东亚人群,突变率高达30%-50%。该位点有两个等位基因:*504Glu(*1)、*504Lys(*2),在人群中基因型有3种情况,野生纯合型(ALDH2*1/*1),产生具有正常催化活性的酶;突变杂合型(ALDH2*1/*2),突变纯合型(ALDH2*2/*2),后两种基因型产生的酶催化活性与野生型比较,均显著下降。研究表明,ALDH2基因突变与高血压、动脉粥样硬化和血脂异常等密切相关,而这些均是AAD的危险因素。基于此,我们推测ALDH2可能是AAD发病机制中一个尚未被认识的关键因素。因此,结合当前国内外研究进展,我们拟通过临床和基础研究深入探讨ALDH2对AAD的影响,探究ALDH2是否通过调控平滑肌细胞表型转化影响AAD发生发展及是否通过调控内皮屏障延缓AAD早期进展。基于中国汉族ALDH2基因30%-50%的高突变率,本研究将对AAD,尤其是我国AAD的预防和治疗策略提供新的思路和方法以及重要科学依据。研究目的(1)明确ALDH2是否通过调控平滑肌细胞表型转化,从而影响AAD进展;(2)探究内皮细胞ALDH2是否通过调控内皮屏障功能,从而影响AAD早期进展;(3)明确ALDH2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的具体分子机制。研究方法第一部分:乙醛脱氢酶2调控平滑肌细胞表型转化在主动脉瘤/夹层中的作用及其机制研究1.1 AAD患者和对照患者临床资料、标本收集AAD纳入标准:经计算机断层扫描确诊AAD。排除标准:马凡综合征、Ehlers-Danlos综合征、二尖瓣主动脉瓣狭窄或反流、恶性肿瘤、妊娠及外伤患者。我们首先在本医院招募2015年12月至2019年6月期间就诊的203例AAD患者和203例对照组,病例与对照组的比例为1:1。此外,在广东省某医院招募2018年7月至2019年5月期间就诊的104名AADRefrigeration患者和196名对照组,病例与对照组的比例为1:2。我们对AAD患者和对照组进行高血压匹配,以消除高血压对AAD的影响。所有对照个体均为来自同一地理区域的非AAD患者,并对年龄和性别进行了匹配。同时收集所有受试者的血液样本和临床信息资料用于后续分析处理。AAD组主动脉样本来自于本医院需接受开放手术修复的AAD患者,对照组样本来自于本医院的心脏移植供体。用Trizol提取人AAD中膜组织和对照样本总mRNA,由北京博奥晶典科技公司进行mRNA测序,随后对其差异基因进行富集分析。1.2动物模型的建立和分组(1)为了探究ALDH2对主动脉夹层的影响:给予4周龄雄性C57BL/6J小鼠饲喂β-氨基丙腈(3-aminopropionitrile fumarate,BAPN)加工饲料4周,构建胸主动脉夹层模型。设置以下4组:①生理盐水(Saline)+DMSO组;②Saline+Daidzin(ALDH2特异性抑制剂)组;③BAPN+DMSO组;④BAPN+Daidzin组。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(2)为了探究ALDH2是否通过miR-31-5p调控AAD发生发展:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠提前28天注射平滑肌细胞特异性过表达miR-31-5p腺相关病毒(AAV2-miR-31-5p,剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵[提前装入血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ),泵速1000 ng/kg/分钟]处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。期间,2天/次腹腔注射Daidzin(剂量75 mg/kg)药物。设置以下4组:①AAV2-scramble+DMSO;②AAV2-scramble+Daidzin;③AAV2-miR-31-5p+DMSO;④AAV2-miR-31-5p+Daidzin。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。1.3人和小鼠主动脉平滑肌细胞的提取及鉴定为了获得人/小鼠原代血管平滑肌细胞,用冷PBS冲洗人/小鼠主动脉组织3-4次。然后轻轻去除内膜和外膜,将组织切成1-2毫米的组织块。随后用0.25%的Ⅱ型胶原酶和0.5%的Ⅱ型弹性蛋白酶37℃处理1小时。在细胞培养箱中培养瓶先正放半个小时,然后倒放一个小时使组织块贴壁更为牢固,最后加入培养基。待细胞培养至4～6代可用于实验。α-SMA免疫荧光染色用于鉴定平滑肌细胞是否提取成功。1.4细胞模型的建立和分组分别培养人主动脉原代平滑肌细胞(Primary Human Vascular Smooth Muscle Cells,HVSMCs)和鼠主动脉原代平滑肌细胞(Primary Mouse Vascular Smooth Muscle Cells,MVSMCs)于含10%胎牛血清(Foetal Bovine Serum,FBS)的VSMC培养基和高糖培养基中,在含5%CO2的37℃孵箱中增殖。主要处理见下:(1)提前半小时给予细胞DMSO(Control)和Daidzin刺激,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下4组:①Control+Saine;②Control+AngⅡ;③Daidzin+Saline;④Daidzin+Ang Ⅱ。(2)提取人ALDH2野生型(Wild Type,WT)和突变型(Mutant)原代平滑肌细胞,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下4组:①WT+Saline;②WT+Ang Ⅱ;③Mutant+Saline;④Mutant+Ang Ⅱ。第二部分:乙醛脱氢酶2调控内皮屏障对主动脉瘤早期的影响2.1动物模型的建立和分组(1)为了探究在AAD早期进展中,ALDH2及内皮屏障功能指标的表达变化:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下3组:①生理盐水(Saline)组;②Ang Ⅱ处理3天;③AngⅡ处理28天。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(2)为了探究内皮细胞条件性敲除ALDH2对AAD的影响:将ALDH2flox小鼠与Tek-creERT2小鼠杂交得到ALDH2ECKO小鼠。给8周龄雄性ALDH2flox小鼠和ALDH2ECKO小鼠提前14天尾静脉注射腺相关病毒(AAV8-Mpcsk9D377Y,剂量2 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下4组:①ALDH2flox+Saline;②ALDH2flox+Ang Ⅱ;③ALDH2ECKO+Saline;④ALDH2ECKO+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(3)为了探究内皮细胞特异性敲低ALDH2对AAD的影响:给予8周龄雄性ApoE-/-小鼠提前28天注射内皮细胞特异性敲低ALDH2腺相关病毒(AAV1-shALDH2,剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下2组:①AAV1-scramble+Ang Ⅱ;②AAV1-shALDH2+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。(4)为了探究ALDH2对内皮屏障功能的影响:给8周龄雄性野生型(WT)小鼠和ALDH2-/-小鼠皮下埋泵(泵速700ng/kg/分钟)处理14天,全程给予普通饲料喂养,构建内皮损伤模型。设置以下4组:①WT+Saline;②WT+AngⅡ;③ALDH2-/-+Saline;④ALDH2-/-+Ang Ⅱ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,14天后小鼠给予安乐死。此外,给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和ApoE-/-ALDH2-/-(DKO)小鼠皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下 4 组:①ApoE-/-+Saline;②ApoE-/-+AngⅡ;③DKO+Saline;④DKO+AngⅡ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。2.2血管通透性检测在Ang Ⅱ处理实验终点,通过尾静脉注射Evans blue染料(100 μL,1%)。待染料循环1小时后,迅速分离小鼠主动脉,进行OCT包埋和冰冻切片,共聚焦显微镜下观察染料在主动脉横截面中的分布情况。2.3小鼠主动脉血管单细胞测序取AngⅡ干预后第0、3、28天的ApoE-/-小鼠主动脉进行酶解,制备单细胞悬液,并检测单细胞活率,进行单细胞mRNA测序。对内皮细胞中差异基因进行富集分析,观察内皮屏障相关调控通路表达变化。2.4细胞模型的建立和分组培养人主动脉原代内皮细胞(Primary Human Aortic Endothelial Cells,HAECs)于 10%FBS的ECM培养基中,在含5%CO2的37℃孵箱中增殖。主要处理见下:(1)时间梯度实验:选用l0-6M Ang Ⅱ别刺激HAECs细胞12小时,24小时,48小时,收集细胞。(2)浓度梯度实验:分别选用 0,10-8M,10-7M,10-6M,10-5M,10-4M 的 AngⅡ刺激HAECs细胞24小时,收集细胞。(3)分别转染shALDH2和GFP(对照)的病毒,然后给予Ang Ⅱ刺激24小时,设置以下 4 组:Ⅱ①Scramble+Saline;②Scramble+Ang Ⅱ;③shALDH2+Saline;④shALDH2+Ang Ⅱ。2.5细胞间通透性检测在共培养皿上室内培养人主动脉内皮细胞,给予AngⅡ刺激,内皮细胞形成单层后,加入FITC-右旋糖酐荧光染料,每隔30分钟检测下室培养基内FITC-右旋糖酐荧光强度,评价内皮细胞间通透性变化情况。第三部分:乙醛脱氧酶2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的机制研究3.1动物模型的构建和分组(1)为了明确转录因子ELK3是ALDH2调控腹主动脉瘤的关键环节:将shELK3序列克隆到pAV-ICAM2-GFP-mir30-shRNA中,得到内皮细胞特异性ELK3干扰腺相关病毒(AAV1-shELK3)。给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和DKO小鼠提前28天注射AAV1-shELK3(剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000ng/kg/分钟)处理28天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下3组:①ApoE-/-+AAVl-scramble+AngⅡ;②DKO+AAV1-scramble+AngⅡ;③DKO+AAV1-shELK3+Ang II。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,28天后小鼠给予安乐死。(2)为了明确转录因子ELK3是ALDH2调控腹主动脉瘤早期进展的关键环节:将ELK3序列克隆到pAV-ICAM2-P2A-GFP中,得到内皮细胞特异性ELK3过表达腺相关病毒(AAV1-ELK3)。给8周龄雄性ApoE-/-小鼠和DKO小鼠提前28天注射AAV1-ELK3(剂量5 × 1011 vg),随后皮下埋泵(泵速1000 ng/kg/分钟)处理7天,并全程给予高脂饲料喂养,构建腹主动脉瘤模型。设置以下2组:①ApoE-/-+AAV1-ELK3+AngⅡ;②DKO+AAV1-ELK3+Ang Ⅱ。期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,相应时间点后小鼠给予安乐死。3.2细胞模型建立和分组培养人脐静脉内皮细胞系(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)和人胚肾细胞(HEK-293T),分别培养在含10%FBS的RPMI1640和高糖DMEM培养基中,于含5%CO2的37℃孵箱中增殖。根据不同处理方式进行分组。(1)人脐静脉内皮细胞系(HUVECs)处理1)体外培养HUVECs细胞,给予10-6MAngⅡ刺激24小时,收集细胞,RT-qPCR观察调控内皮屏障相关指标的转录因子表达情况;2)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞ELK3、TEAD1、FOS的小干扰RNA敲减其表达,收集细胞,RT-qPCR观察内皮屏障相关指标表达情况;3)体外培养HUVECs细胞,利用Lipo3000转染细胞ELK3质粒,进行双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)实验,观察ELK3对内皮屏障相关指标转录的影响;4)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞ELK3小干扰敲减ELK3表达,同时转染shALDH2慢病毒敲减ALDH2表达,给予10-6 M Ang Ⅱ刺激24小时,收集细胞,RT-qPCR观察内皮屏障相关指标表达情况;5)体外培养HUVECs细胞,利用RNAiMAX转染细胞LIN28B的小干扰RNA敲减其表达,收集细胞,RT-qPCR和western blot观察ELK3和内皮屏障相关指标的表达情况。(2)人胚肾细胞(HEK-293T)处理构建带Flag标签的ALDH2过表达质粒和带HA标签的LIN28B过表达质粒,利用Lipo3000转染试剂共转染体外培养的HEK-293T细胞,进行免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)和免疫荧光实验,观察ALDH2和LIN28B结合情况。3.3激光共聚焦检测ALDH2和LIN28B的共定位将带Flag标签的ALDH2过表达质粒和带HA标签的LIN28B过表达质粒共转染HEK293T细胞系,细胞免疫荧光染色后,利用激光共聚焦显微镜检测ALDH2和LIN28B在细胞内的共定位情况。3.4 Co-IP 实验体外培养人脐静脉内皮细胞,利用内源性抗体进行Co-IP检测内源性目的分子的结合情况。体外培养HEK293T细胞,构建各种目的分子的过表达质粒转染细胞,利用标签抗体进行Co-IP检测外源性目的分子的结合情况。3.5 RNA 免疫沉淀反应(RNA immunoprecipitation,RIP)实验体外培养HUVECs细胞,利用RNA免疫共沉淀试剂盒检测与目的蛋白结合的mRNA表达情况。统计学分析为研究ALDH2基因型与AAD风险的关系,采用logistic回归方法计算优势比(OR)及其95%可信区间(95%CI)。连续变量以均值±标准差表示,分类变量以数量和百分比(%)表示。采用ShapZD1839价格iro-Wilks检验进行数据分布的正态性假设评估。采用Brown-Forsythe检验进行正态分布数据间方差齐性检验。采用非配对t检验分析两组间数据统计差异,采用单因素方差分析多组间数据统计差异。非参数检验用于非正态分布或样本量小的数据。两组间比较采用Mann-Whitney检验,两组以上比较采用Kruskal-Wallis检验和Dunn’s多重比较检验。P<0.05被视为具有统计学差异。所有实验至少重复3次。使用GraphPad Prism 8.0版本进行数据分析。研究结果第一部分:乙醛脱氢酶2调控平滑肌细胞表型转化在主动脉瘤/夹层中的作用及其机制研究1.1 ALDH2基因突变与AAD患病率呈负相关我们首先在本医院开展了前瞻性的病例对照研究,在校正了包括高血压、年龄、性别、吸烟、冠心病、高脂血症等常规危险因素后,发现与ALDH2基因野生型(GG)相比,ALDH2基因突变型(GA/AA)携带者主动脉夹层/瘤发病风险显著降低50.4%(OR=0.496,95%CI 0.256～0.958,p=0.037)。之后在广东开展了另一项独立的病例对照研究,发现与ALDH2基因野生型(GG)相比,ALDH2基因突变型(GA/AA)携带者主动脉夹层/瘤发病风险显著降低43.5%(OR=0.565,95%CI 0.346～0.919,p=0.025)。这些结果显示,ALDH2基因突变可显著降低AAD的发病风险。1.2抑制ALDH2活性显著降低小鼠AAD发病率BAPN加工饲料处理前后各组小鼠收缩压无统计学差异,但BAPN加工饲料处理的小鼠舒张压低于正常饲料处理组。与对照组相比,抑制ALDH2活性减轻BAPN诱导的小鼠胸主动脉的扩张程度,减少小鼠胸主动脉夹层形成,提高小鼠生存率,减缓BAPN诱导的血管病理变化。而激活或过表达ALDH2对小鼠动脉夹层发生发展无明显影响。1.3 ALDH2基因缺乏通过激活myocardin,抑制平滑肌细胞表型转化,对AAD发挥保护作用通过对3例主动脉夹层患者及其3例对应健康对照组的血管进行mRNA测序,结果显示主动脉夹层患者血管中有1894个基因下调,这些基因主要调控血管结构发育、细胞外基质和肌肉收缩等生物学功能。而维持血管平滑肌细胞收缩表型的基因下调尤为明显,这表明平滑肌细胞表型转化在疾病发生发展过程中起着重要作用。鉴于myocardin在平滑肌细胞稳态中的关键作用,我们对ALDH2基因敲除小鼠和野生型小鼠的主动脉组织中myocardin相关基因进行GO富集分析,结果显示,与ALDH2野生型相比,ALDH2基因敲除组α-SMA和SM22-α基因表达显著增高。以上结果表明,ALDH2基因缺乏可能通过激活myocardin,抑制平滑肌细胞表型转化,对AAD发挥保护作用。1.4 ALDH2基因缺乏可通过下调miR-31-5p的表达,抑制AAD进展超声结果显示,与对照组相比,AAV2-miR-31-5p增加小鼠主动脉的扩张程度。大体和超声结果显示,AAV2-miR-31-5p造成小鼠动脉瘤发生率和死亡率增加。RT-qPCR和western blot结果均显示,AAV2-miR-31-5p下调myocardin表达水平。而抑制ALDH2活性可改善上述情况,发挥血管保护作用,减少小鼠动脉瘤发生率,提高小鼠生存率。1.5 ALDH2基因缺乏可通过上调Max的表达,抑制miR-31-5p水平生信分析预测发现,miR-31-5p启动子区域存在两个潜在的Max结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示,转录因子Max明显抑制野生型miR-31-5p转录活性,而对突变型miR-31-5p转录活性无影响。提取ALDH2野生型和ALDH2基因敲除小鼠平滑肌细胞,进行AngⅡ刺激,发现ALDH2基因敲除后Max水平显著增加。使用Max干扰RNA敲减Max表达后,miR-31-5p表达显著上调。以上结果表明,ALDH2基因缺乏可通过上调Max的表达,抑制miR-31-5p水平。1.6 ALDH2-miR-31-5p-myocardin 轴调控人 VSMCs 的表型转换提取人原代血管平滑肌细胞进行实验,RT-qPCR结果显示,AngⅡ处理2PF-03084014 IC504小时后,miR-31-5p表达增加,myocardin和平滑肌细胞收缩型标志物α-SMA、SM22-α和Calponin表达显著降低。与ALDH2野生型相比,ALDH2突变型平滑肌细胞可改善Ang Ⅱ导致的上述变化。第二部分:乙醛脱氢酶2调控内皮屏障对主动脉瘤早期的影响2.1 AAD患者主动脉内皮屏障功能受损对3例对照与6例AAD患者的主动脉内膜进行了 Bulk mRNA测序,结果显示,与对照组相比,AAD患者主动脉内膜中Focal adhesion相关通路显著下调,位居第五位;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,AAD患者主动脉内膜组织中内皮屏障相关指标表达显著降低。2.2 AAD小鼠在动脉瘤早期内皮屏障功能受损通过对Ang Ⅱ干预后第0、3、28天的ApoE-/-小鼠主动脉组织进行单细胞测序,描绘了小鼠AAD不同进展过程中基因表达的动态变化图谱,并对内皮细胞中差异基因进行了 GO富集分析,结果显示,与对照组(0天)相比,AngⅡ干预第3天和第28天小鼠主动脉内皮细胞中Focal adhesion相关通路均显著下调。这些结果表明,内皮屏障功能受损是AAD进展的早期事件。2.3 ALDH2在主动脉瘤/夹层组织中表达上调对AAD患者和对照组主动脉组织进行了免疫组化和免疫印迹实验,结果显示,与对照组相比,ALDH2在AAD患者主动脉内膜和中膜中表达均显著上调。2.4内皮细胞特异性敲除/敲低ALDH2抑制小鼠腹主动脉瘤发生将ALDH2flox小鼠与Tek-creERT2小鼠杂交得到ALDH2ECKO小鼠,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲除ALDH2可降低小鼠腹主动脉成瘤率和死亡率,减轻小鼠主动脉血管扩张程度,改善了 AngⅡ诱导的血管组织病理变化。AAV作为基因治疗中最常用的病毒载体之一,因其稳定、高效、无细胞毒性的特性,在基因治疗中具有广泛应用前景。我们构建了内皮细胞特异性敲低ALDH2腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ALDH2可降低小鼠腹主动脉成瘤率,减轻小鼠主动脉血管扩张程度,改善了 Ang Ⅱ诱导的血管组织病理变化。2.5 ALDH2基因敲除/敲低保护内皮屏障功能AngⅡ 刺激后,内皮屏障指标 JAM-A、VE-cadherin、p120-cadherin 和 Claudin5 表达显著下调,Vinculin反应性上调,而ALDH2基因敲除/敲低可改善上述指标变化。2.6内皮细胞特异性敲低ALDH2可通过保护内皮屏障功能,减轻小鼠主动脉早期扩张程度结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ALDH2可明显上调内皮屏障相关指标的水平,抑制主动脉早期扩张程度,改善AngⅡ诱导的血管组织病理变化。第三部分:乙醛脱氧酶 2调控内皮屏障影响主动脉瘤早期的机制研究3.1转录因子ELK3促进内皮屏障功能使用小干扰RNA抑制ELK3表达,内皮屏障指标Vinculin、JAM-A、Claudin5、VE-cadherin和p120-cadherin表达显著下调。荧光素酶报告基因结果显示,ELK3促进JAM-A、Claudin5和VE-cadherin的转录。ChIP结果显示,过表达ELK3增加了其与Claudin5启动子的结合。3.2.ALDH2通过转录因子ELK3调控内皮屏障功能在AngⅡ处理的人脐静脉内皮细胞中,使用小干扰抑制ELK3表达后,内皮屏障相关指标 Vinculin、JAM-A、Claudin5、VE-cadherin 和 P120-catenin 的表达显著下调,而敲减ALDH2后可改善上述变化。3.3 ALDH2 促进 ELK3 mRNA 降解RT-qPCR结果显示,敲除ALDH2可增强ELK3 mRNA水平。荧光素酶报告基因实验结果显示,ALDH2对ELK3转录无明显影响。接下来,使用放线菌素D抑制基因转录,发现与对照组相比,过表达ALDH2加快了 ELK3 mRNA降解速率,导致ELK3 mRNA稳定性降低。3.4 LIN28B 稳定 ELK3 mRNA蛋白质谱实验和Co-IP结果显示,LIN28B可以与真核翻译起始因子、延伸因子、RNA解旋酶A等直接结合,从而调控目标mRNA的转录和翻译。使用小干扰RNA干扰LIN28B表达后,ELK3的mRNA和蛋白水平显著降低。使用放线菌素D抑制基因转录,发现与对照组相比,干扰LIN28B后ELK3 mRNA稳定性降低。3.5 ALDH2直接结合LIN28B,降低ELK3 mRNA稳定性Hdock预测结果显示ALDH2与LIN28B可能存在直接结合。Co-IP和免疫荧光实验证实了这一发现。为了进一步明确ALDH2-LIN28B在调节内皮屏障功能中的作用,我们进行了 RIP实验,结果显示,ALDH2可拮抗ELK3 mRNA与LIN28B的结合。在ALDH2敲减的HAECs中,使用了小干扰下调LIN28B水平,western blot和免疫荧光结果显示,敲减ALDH2可上调内皮屏障相关指标变化,而干扰LIN28B后内皮屏障指标表达显著下调,敲减ALDH2的保护作用消失。3.6内皮细胞特异性敲低ELK3促进小鼠腹主动脉瘤发生发展构建内皮细胞特异性敲低ELK3腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤模型的构建。结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性敲低ELK3显著增加小鼠腹主动脉成瘤率和主动脉最大扩张程度,明显加重Ang Ⅱ诱导的血管组织病理变化。3.7内皮细胞特异性过表达ELK3抑制小鼠腹主动脉瘤早期进展构建了内皮细胞特异性过表达ELK3腺相关病毒,并进行小鼠腹主动脉瘤早期模型的构建。在实验早期对小鼠进行取材,结果显示,与对照组相比,内皮细胞特异性过表达ELK3可改善Ang Ⅱ导致的主动脉早期扩张程度和血管组织病理变化。研究结论1.ALDH2基因突变降低AAD发病风险;2.ALDH2基因突变可上调myocardin表达,维持平滑肌细胞收缩表型,对AAD发挥保护作用;3.内皮特异性ALDH2敲除/敲低可保护内皮屏障功能,抑制AAD早期扩张。