近年来,随着我国对水产品需求的日益增长,特种经济水产品养殖数量和密度不断上升,如何有效降低病害的发生和抗生素的使用以提高经济水产品的品质,已成为目前急需解决的问题。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)作为我国重要的经济养殖蟹类,深受大众喜爱,但随着养殖规模和密度的日益扩大,同样面临病害发生的各种风险。因此,深入开展该蟹基础免疫学的研究,可为该蟹乃至其它甲壳动物病害防控、疫苗研发以及未来的抗病分子育种提供重要的理论支撑。白细胞介素(interleukins,ILs)是一种在先天性免疫和获得性免疫中都能够发挥重要功能的细胞因子。脊椎动物IL种类繁多,功能各样,其超家族成员主要是由CD3~+和CD4~+T淋巴细胞产生和分泌,可以促进免疫相关细胞的发育和分化,从而参与免疫系统的调节。但迄今为止,只有极少数ILs基因在进化上可以追溯到无脊椎动物。白介素16(IL-16)作为一种促炎症因子,在脊椎动物中通过与受体CD4结合从而募集CD4~+细胞向炎症部位转移并促进细胞增殖、分化。而IL-16作为中华绒螯蟹目前唯一一种鉴定获得的白介素,其发挥的生物学功能尚不明确,尤其是IL-16在脊椎动物中的受体是CD4,而无脊椎动物没有该受体。因此,深入探究IL-16在中华绒螯蟹中的相互作用蛋白及其调控功能,可以更好地帮助我们从进化的角度理解脊椎动物和无脊椎动物免疫机制的区别与联系。本论文通过对中华绒螯蟹全基因组序列和转录组信息的筛查获得了Es IL-16的全长序列,并通过PCR扩增和测序进一步验证了Es IL-16的开放阅读框(ORF)序列。经生物信息学分析发现,Es IL-16在进化上相对保守,特别是不同物种间都具有相同的PDZ功能域。Es IL-16在所检测的各个组织中均有表达,但在被以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌和以副溶血弧菌为代表的革兰氏阴性菌刺激后,Es IL-16在血细胞中的表达显著上调,初步说明Es IL-16与免疫反应相关。Es IL-16同样存在前体pro-IL-16的形式,亦存在Caspase-3切割位点,经实验验证发现在正常情况下Caspase-3切割酶处于无更多活性或活性较弱状态,但在菌刺激后Caspase-3切割酶被激活并切割pro-IL-16产生大量有活性的成熟IL-16。经核质分离等实验进一步证实,其N端部分可以入核,而C端形成成熟肽被分泌出细胞。那么,中华绒螯蟹成熟IL-16分泌出细胞后与哪种受体结合?又行使什么生理功能?为解决上述问题,我们利用T7噬菌体展示文库,以Es IL-16为配体蛋白进行受体筛选,并通过Co-IP技术、激光共聚焦技术以及结合功能域验证等手段对候选受体进行验证,结果证实Es IL-16的受体是整合素β1(Es Integrinβ1),其中Es IL-16结合了Es Integrinβ1的Izoonotic infectionNB功能域,而Es Integrinβ1结合了Es IL-16的非PDZ区域。通过Qrt-PCR检测发现,Es Integrinβ1在中华绒螯蟹各个组织中广泛表达,且在金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激后其血细胞的表达量显著升高,同样暗示Es Integrinβ1在抗菌免疫中发挥积极作用。鉴于IL-16与Integrinβ1在脊椎动物中均具有促进细胞增殖的功能,为此本研究利用EDU和CFSE细胞增殖检测技术对中华绒螯蟹血细胞进行了检测,结果发现,经菌刺激12小时后加入重组Es IL-16蛋白会显著促进中华绒螯蟹血细胞的增殖,而相同条件下对Es Integrinβ1基因进行敲降,与对照组相比血细胞几乎不存在增殖现象。上述研究结果进一步证明Es IL-16促进细胞增殖必须通过与受体Es Integrinβ1结合才能发挥功能。同时使用RNAi技术敲降Es Integrinβ1基因和使用RGD(Integrinβ1)抑制剂处理细胞后,血细胞凋亡率会明显上升。为进一步探究Es IL-16与Es Integrinβ1结合促进血细胞增殖的机制,本论文对调控细胞周期的两种蛋白Cyclin E和Cyclin B的表达情况进行了研究。经菌刺激12小时后加入重组Es IL-16蛋白,利用Qrt-PCR技术检测了Cyclin E和Cyclin B的表达情况,结果发现Cyclin E的表达量显著升高而Cyclin B与对照组相比则无显著差异,这也暗示Es IL-16与Es Integrinβ1结合后通过促进Cyclin E的高表达,最终促进了细胞增殖。为进一步验证Es IL-16与Es Integrinβ1结合后,通过怎样的信号传导方式高表达Cyclin E进而促进血细胞增殖,本研究使用抑制剂及RNAi敲降技术降低Es Integrinβ1及其下游信号通路的相关基因,再通过蛋白印迹法检测Cyclin E的蛋白表达,结果发现,Es IL-16与Es Integrinβ1结合后能够促进黏着斑激酶(FAK)磷酸化,最终通过激活某条信号通路,上调Cyclin E的基因表达,随着Cyclin E蛋白的大量积累,促进血细胞G1前期向G1后期过渡,最终促进血细胞增殖。此外,通过研究发现,Es Integrinβ1通过磷酸化FAK促进ERK磷酸化入核,抑制Caspase-3切割酶的活性从而抑制细胞凋亡。综上所述,本研究证实了IL-16在无脊椎动物中华绒螯蟹中的受体是Integrinβ1,并能够通过上调细胞周期蛋白Cyclin E进而促进血细胞的增殖。并且Integrinβ1在中华绒寻找更多螯蟹中通过FAK/ERK途径调控血细胞凋亡。这一研究丰富了IL-16在无脊椎动物中所参与的免疫调控机制,更在进化层面打开了无脊椎动物与脊椎动物免疫系统研究的新视角。