D-丹参素(Salvianolic acid,SAA)被广泛用于治疗心脑血管等疾病,具有多种药理学功效,如抗炎、抗肿瘤、抗衰老等,可以有效改善患者的健康状况。目前,D-丹参素的合成技术可分为化学法和酶转化法,前者的工艺复杂,生产成本昂贵且很难获得具有光学纯度的D-丹参素;相比之下,酶转化法的成本较低,但是底物的负载量少使得时空产率较低GDC-0973小鼠。因此,开发一种高效合成D-丹参素的工艺路线具有重要的意义。在本研究中,我们构建了一条以L-多巴(L-DOPA)为底物的三酶级联路径,在来源于变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶(PmLAAD)、来源于乳酸菌的苯丙酮酸还原酶(LaPPR)和来源于假丝酵母的甲酸脱氢酶(CbFDH)的催化作用下合成D-丹参素。通过蛋白质工程改造提升LaPPR的催化活性并对路径酶的表达水平进行优化,最终提高了该级联路径合成D-丹参素的更多效率。主要的研究结果如下:(1)D-丹参素合成路径的设计、构建和验证。首先,通过调研文献和分析酶数据库比较不同来源酶的活性,选择酶活性较高的来源于变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶PmLAAD~(M2)(H295S/V437S)、来源于假丝酵母的甲酸脱氢酶(CbFDH)和来源于乳酸菌的苯丙酮酸还原酶(LaPPR)用于催化该级联反应,经体外纯酶催化的反应验证了该级联路径可以实现D-丹参素的合成,并进一步比较不同浓度的纯酶对产物生成速率的影响,确定了LaPPR为该级联反应的限速酶。(2)LaPPR的结构特征与催化机理。首先解析了LImmune clustersaPPR空蛋白的晶体结构,在晶体结构的基础上构建野生型LaPPR-NADH-DHPPA的对接模型并进行初步分析,推测了LaPPR的催化机理,根据LaPPR-NADH-DHPPA复合物MD模拟的计算结果及其代表性快照,表明催化过程中较长的氢化物转移距离d_1和质子转移距离d_2是LaPPR催化活性较低的关键因素。(3)蛋白质工程改造提高LaPPR的催化活性。通过分析催化机理及底物结合模式,设计突变体库,经过迭代饱和突变和组合突变获得了最优突变体LaPPR~(Mu2)(H89M/H143D/P256C),其比活性和催化效率(K_m/k_(cat))相对于野生型分别提升了2.8倍和9.3倍。由MD模拟的计算结果,对比分析LaPPR-NADH-DHPPA和LaPPR~(Mu2)-NADH-DHPPA复合物的代表性快照,发现突变后氢化物转移距离d_1和质子转移距离d_2分别从3.97(?)和4.12(?)缩短为3.51(?)和4.01(?),催化活性的构象数目占总构象的比例大幅度增加(由42/25000提升至610/25000),从而使LaPPR的催化活性提升。(4)三酶组装合成D-丹参素。将PmLAAD~(M2)、LaPPR~(Mu2)和CbFDH构建到同一菌株内,分别通过不同拷贝数质粒和RBS序列调控了三酶的体内酶活比例,得到最优菌株E.coli YJH11,此时三酶的体内酶活比例与体外最优酶活比例接近,最后优化了发酵产酶条件和转化条件,在最优条件的基础上,通过分批补料,最终将90 g·L~(-1) L-多巴转化生成82.6 g·L~(-1) D-丹参素,转化率为91.3%,ee>99%。