当前仔猪腹泻是一直是困扰生猪养殖业的重要难题,随着生猪规模化养殖产业的不断扩大,仔猪病毒性腹泻疾病的流行呈现逐年升高的态势,严重损害养殖业经济效益。目前很多研究表明益生菌制剂与中兽药单独使用或与抗菌药、疫苗联合应用治疗仔猪腹泻效果显著。益生菌和中药既具备抑菌、抗病毒、增强机体抵抗力的功效,又具有天然环保、来源广泛、功效多样等优势,避开了抗生素临床应用存在的弊端。本研究通过分离鉴定有优良益生特性的乳酸菌株,进行中药发酵,研究乳酸杆菌selleckchem ICI 46474及其代谢产物、单味中药煎剂及乳酸杆菌发酵中药煎剂体外抑制PEDV增殖的能力,并利用网络药理学和分子对接技术探究优势中药黄柏作用于仔猪病毒性腹泻的机制。试验一三株乳酸杆菌的分离鉴定及其益生特性的研究从发酵青贮料Smoothened Agonist体内实验剂量中分离乳酸菌株,经培养特性、革兰氏染色显微镜检查和16S r RNA分子生物学分析,筛选鉴定出两株植物乳杆菌HN11、HN22和一株干酪乳杆菌HN12。本研究对分离菌株的生长曲线、耐酸性、耐胆盐性、抑菌能力、抗生素敏感性和动物体内安全性等性能进行研究,结果表明所有受试菌株均在4 h进入对数生长期并在16 h进入稳定期,表现出良好的产酸、耐酸和耐胆汁能力,鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均对三株分离菌株表现为高敏,肠致病性大肠杆菌对HN11和HN22菌株表现为低敏,而肠致病性大肠杆菌对HN12菌株表现为不敏感。抗生素敏感性试验结果表明分离菌株对多种抗生素敏感,而对林可霉素和诺氟沙星表现出耐药。将浓度为1.0×10~8CFU/m L的乳酸杆菌HN11、HN12和HN22菌悬液灌服小鼠,进行动物安全性试验,发现小鼠生长状况、精神状态、内脏和肠道组织表现正常,表明分离菌株对小鼠无毒害作用。本研究结果为乳酸杆菌分离菌株的进一步开发利用提供一定的理论基础。试验二乳酸杆菌及其代谢产物体外抗PEDV作用调整乳酸杆菌HN11、HN12、HN22菌悬液浓度为1.0×10~8CFU/m L后离心取上清,经0.22μm过滤后获得代谢上清产物,离心后的菌体PBS重悬获得菌悬液,菌悬液经100℃水浴10 min获得热灭活产物。将乳酸杆菌菌悬液、代谢上清和热灭活产物通过预处理、共处理和后处理三种方式接种到PEDV感染的Vero细胞中,利用CCK8试剂盒检测各处理组细胞活力,结果显示乳酸杆菌菌悬液、热灭活产物、代谢上清均可抑制PEDV的增殖,热灭活产物和代谢上清在预处理和共处理方式下对PEDV的抑制率均高于菌悬液,且预处理和共处理作用下各乳酸杆菌的热灭活产物和代谢上清产物处理之间不具有显著性差异(P>0.05)。利用荧光定量PCR方法检测乳酸杆菌菌悬液及其代谢产物与PEDV同时接种于Vero细胞后的PEDV拷贝数,结果表明,与病毒对照组相比,HN11代谢上清处理组PEDV拷贝显著降低(P<0.05)。试验三乳酸杆菌发酵中药煎剂抗PEDV作用通过Rev Man 5.4软件对中药制剂治疗猪病毒性腹泻的疗效评价进行Meta分析,结果显示,与西药对照处理组相比,中药复方制剂对猪病毒性腹泻疾病的治愈率显著升高(P<0.01)。选择使用频率较高的三种清热解毒燥湿药黄连、黄柏、苦参进行接下来的发酵单味中药抗病毒研究。在试验二研究的基础上,调节植物乳杆菌HN11、干酪乳杆菌HN12浓度为1.0×10~8CFU/m L,以4%的接入量厌氧发酵浓度为1g/m L的黄连、黄柏、苦参煎剂36 h后,活菌平板计数法检测各发酵中药煎剂中活菌数,结果表明乳酸杆菌HN11、HN12活菌数目在黄连、黄柏和苦参煎剂中发酵36 h后未发生显著变化。高效液相色谱法(HPLC)检测黄连煎剂和黄柏煎剂发酵前后的盐酸小檗碱含量变化,以及苦参煎剂发酵前后的苦参碱含量变化,结果表示发酵黄连、黄柏煎剂中盐酸小檗碱含量,发酵苦参煎剂中苦参碱含量较发酵前均提高数倍。利用CCK8试hepatolenticular degeneration剂盒检测黄连、黄柏、苦参煎剂和发酵中药煎剂接种于Vero细胞上的最大无毒剂量,并将最大无毒剂量的黄连、黄柏、苦参煎剂和发酵中药煎剂分别与PEDV同时作用于Vero细胞后,荧光定量PCR检测结果显示各处理组PEDV拷贝相较于病毒对照组均有所降低,且以发酵黄柏煎剂作用效果极为显著(P<0.001),将黄柏煎剂和发酵液以预处理、共处理、后处理方式作用PEDV后,利用CCK8试剂盒检测不同处理组细胞活力,发现黄柏煎剂处理组、乳酸杆菌HN11发酵黄柏煎剂处理组和HN12发酵黄柏煎剂处理组之间对PEDV的抑制率不具有显著性差异(P>0.05),并且以预处理和后处理方式效果较佳,抑制率可高达50%以上。试验四基于网络药理学和分子对接技术探究中药黄柏对仔猪腹泻的作用机制利用TCMSP数据库筛选黄柏活性成分及其对应的靶点基因,通过Gene Cards、OMIM和NCBI数据库获取仔猪腹泻相关靶点;将黄柏活性成分靶点与仔猪腹泻靶点取交集后,构建蛋白互作PPI网络;利用DAVID分析核心靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析;采用Auto Tools进行分子对接验证,并通过Py Mol软件将结果可视化。结果表明,黄柏作用于仔猪腹泻的活性成分主要是槲皮素、β-谷甾醇、异紫堇杷明碱、吴茱萸次碱,通过癌症通路、MAPK信号通路、PI3K-AKt通路、IL17信号通路等多条途径发挥作用,其作用的靶点为TNF、TP53、IL-6等,探究了黄柏的多成分、多途径、多靶点作用机制。研究中我们发现黄柏具有抗炎活性,可参与调节炎症反应,这也可能是黄柏发挥抗病毒作用的关键因素。综上所述,本研究分离得到的乳酸杆菌具有优良的益生特性和抗PEDV能力,且黄柏煎剂和乳酸杆菌HN11、HN12发酵黄柏煎剂抗PEDV效果均显著,中药黄柏可通过多成分、多途径、多靶点作用于仔猪腹泻疾病。