有机农药相关的环境暴露与生态健康风险评估,一直是环境科学研究领域前沿研究热点之一。三唑类杀菌剂(TFs)因其高效、低毒、持效性长等特点,广泛应用于保护谷物、水果和蔬菜作物。多项研究证实,TFs广泛残留并在生物体内积累,导致毒性效应不一,继而引起内分泌干扰效应、生殖毒性、神经毒性以及胚胎发育Lapatinib molecular weight毒性等。然而,目前针对此类污染物的研究仅揭示了几种杀菌剂的有限毒性终点,亟须建立高通量的生物安全性评估系统,为此本课题拟开展基于高通量核受体风险评估系统的化合物活性鉴定和健康效应研究,在此基础上进一步阐明其致毒机制,为减轻农药污染、降低对非靶标生物的危害提供技术支持和科学依据。主要研究内容如下:1.研究发现TFs暴露能对非靶标生物产生内分泌干扰效应,因此亟待对其开展高通量生物安全性评估。本部分研究,基于基因表达谱结果建立了基于雌激素受体α(ERα)的体外高通量筛选模型,考查五种TFs(己唑醇(HEX)、戊唑醇(TEB)、丙环唑(PRO)、环丙醇(CYP)和苯醚甲环唑(DIF))的雌激素干扰效应及偶联的代谢影响。功能富集分析(GO分析)结果发现biocatalytic dehydration,TFs暴露后差异表达基因(DEGs)显著富集在雌激素信号通路,特别是雌激素合成过程。此外,双荧光素酶报告基因结果发现4种TFs(TEB、CYP、PRO和DIF)对ERα具有激动活性。通过分子对接计算模拟进一步证明了TFs与ERα的结合方式,其结果与荧光素酶报告基因结果一致。进一步研究发现,四种TFs(TEB、PRO、CYP、DIF)干扰了调控雌激素合成相关基因的表达,并刺激雌二醇(E_2)的分泌。最后,对细胞样品进行脂质组学分析,评估了TFs影响雌激素合成对代谢稳态的干扰效应,结果表明TFs能影响脂类、蛋白质和碳水化合物等多种大分子的代谢和信号传导过程。以上结果提示TFs可激活ERα并诱导内分泌干扰效应,进而影响了相关的代谢稳态。2.前期研究已经证实TFs可引发非靶标生物的健康问题。然而,现有的实验证据主要集中于研究单一TFs对胚胎发育的影响,忽略了多种TFs对特定发育结局的筛选及相关机制的探究。在本部分研究中,利用糖皮质激素受体α(GRα)介导的双荧光素酶报告基因系统和转录组测序分析考察其对造血发育的影响。双荧光素酶报告基因系统评估了10种TFs(HEX、TEB、PRO、CYP、DIF、三唑醇(TRI)、戊菌唑(PEN)、氟硅唑(FLU)、腈菌唑(MYC)、氟环唑(EPO))对GRα的点击此处干扰效应,根据20%相对效应浓度(REC_(20))比较发现FLU>CYP>DIF>PRO>EPO>HEX,其中FLU对GRα有较强的激动活性。随后转录组测序结果提示FLU暴露斑马鱼对促肾上腺皮质激素释放、胚胎造血、红细胞分化、造血或淋巴器官发育等生物过程产生影响。使用胚胎原位杂交技术和染色技术,进一步研究FLU暴露对斑马鱼胚胎造血发育过程(原始造血、中间造血和定向造血)的影响。发现FLU暴露后原始造血标记基因gata1和pu.1表达减少,随着发育的进行,斑马鱼胚胎出现后部血岛(PBI)缺陷进而影响了中间造血过程。此外,FLU暴露能够显著降低定向造血关键基因cmyb表达,破坏定向造血过程中红细胞和骨髓细胞的生成。组织病理学结果提示,长期暴露于FLU导致斑马鱼造血器官出现肾内炎症细胞浸润、肾小管塌陷、肾小管滤过面积减少和肾间质水肿等发育缺陷变化。此外造血结局表明,FLU导致斑马鱼外周血细胞中畸形红细胞的增加和骨髓细胞的减少。本部分研究为FLU暴露诱导造血发育异常提供了实验证据。3.我们前期研究发现TFs会引起造血发育异常,而造血改变与心脏疾病风险增加显著相关。为此,本部分研究结合双荧光素酶报告基因系统和在体斑马鱼暴露模型,系统评价了10种TFs对心脏发育的影响及其可能的分子机制。双荧光素酶报告基因结果表明,其中5种TFs具有过氧化物酶激活受体γ(PPARγ)激动活性,其强弱排序为DIF>EPO>CYP>PEN>FLU。分子对接模拟数据显示DIF通过碳—氢键、π—硫、烷基和π—烷基与PPARγ结合。斑马鱼在体实验结果表明,DIF暴露诱导PPARγ高表达。此外,暴露引起斑马鱼胚胎心率下降、血流量异常及心脏功能受损。转录组测序结果显示,Wnt信号通路在DIF暴露诱导心脏发育异常中发挥了重要作用。PPARγ抑制剂(GW9662)暴露斑马鱼可有效缓解DIF引起的Wnt信号通路改变。检测结果证实,DIF可激活PPARγ,改变Wnt信号通路相关基因的表达,促进β-连环蛋白(β-catenin)磷酸化,抑制Wnt/β-catenin信号通路,导致斑马鱼出现心包水肿。先前的研究表明Wnt信号通路与心脏左右不对称发育之间存在联系。斑马鱼胚胎原位杂交实验结果显示DIF暴露可改变心脏发育早期库氏囊泡(KV)大小,影响左右不对称相关基因表达,引起心脏左右不对称发育缺陷,最终导致心脏发育异常。4.近期研究发现,TFs可通过血液循环进入大脑,透过血脑屏障影响大脑神经发育。为深入解析FLU暴露导致脑损伤及其相关作用机制,本部分主要探究FLU对斑马鱼幼鱼及长期暴露下成鱼的行为和脊髓的影响。首先,通过胚胎自发运动、斑马鱼幼鱼明暗交替运动和镜面攻击实验,发现FLU暴露诱导斑马鱼幼鱼行为异常(焦虑行为)。通过苏木精—伊红(HE)染色观察脊髓形态,发现FLU暴露组脊髓呈现不同程度的损伤,具体表现为:脊髓中出现出血现象、脊索严重变形、肌细胞数量减少以及肌间隙变大。斑马鱼幼鱼中DEGs的基因组富集分析(GSEA)结果表明,幼鱼神经发育相关基因发生改变,GO分析结果显示DEGs富集于突触组装、学习或记忆、认知、短期记忆、长期记忆以及对压力的反应等生物学过程。为了解幼鱼时期神经损伤是否会持续到成年期,进一步检测了从胚胎开始持续暴露90天后斑马鱼成鱼的行为学(底栖实验、社交实验和T—水迷宫实验)变化情况,结果表明FLU长期暴露也会影响成鱼的情绪(焦虑和恐惧),学习和记忆能力。同时,长期暴露FLU导致斑马鱼脊髓内出现空泡,神经细胞肿胀,间质疏松,毛细血管淤血现象。除此以外,脊索也出现内泡细胞病变。本研究为探讨幼鱼期FLU暴露与长期暴露至成年期的神经发育毒性的相关性提供了实验证据。本研究首先从ERα相互作用出发,基于转录组—受体信号通路—代谢的作用机制信息,揭示了TFs诱导内分泌干扰效应及相关的代谢异常,初步构建了TFs对非靶标生物健康风险的有害结局路径。在此基础上,通过GRα阐明了TFs诱导造血发育过程异常,建立对发育毒性发生进行早期检测和风险评价的分子靶标。基于DIF与PPARγ的相互作用,扰乱Wnt信号通路诱导心脏不对称发育,证实TFs的心脏毒性。最后,探讨了FLU暴露对神经功能的影响及其可能的信号响应,为TFs健康风险评估提供了实验证据。