背景:周围神经损伤是由外伤或慢性疾病引起的一种常见的神经系统疾病,常伴随着神经性疼痛和功能障碍。尽管近年来手术修复技术有所改进,但功能恢复仍不尽如人意。事实上,成功的神经修复不仅取决于手术策略,还取决于参与创伤性神经损伤后的细胞和分子机制。因此目前的研究状态正在从主要关注手术修复方法转向影响创伤后神经元和胶质细胞死亡、雪旺细胞增殖、迁移和分化、轴突生长和定向等关键因素的分子机制和新策略。众所周知,药物疗法是一种廉价、容易获得和非侵入性的治疗方法,可以在神经损伤后立即使用。这对于改善创伤后神经元的微环境大有助益。香菇是具有代表性的药食两用真菌,被誉为“菇中之王”营养价值高,具有保健的功效。而香菇多糖是从香菇中提取的具有天然生物活性的一种纯化多糖,具有如免疫增强、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种药理学活性特征,因此具有良好的应用前景。此外,香菇多糖还在自噬调节方面具有重要作用,而雪旺细胞(schwann cells,SCs)的自噬对周围神经损伤(peripheral nerve injury,PNI)后的髓鞘碎片降解和清除至关重要。但是目前还不清楚香菇多糖对神经损伤后的作用,以及其产生的效果是否与加速神经损伤后髓鞘碎片的自噬清除密切相关。目的:本研究旨在探讨香菇多糖对大鼠坐骨神经挤压损伤修复的作用和及其相应的分子机制。方法:1、通过网络药理学预测了香菇多糖与神经损伤后更多轴突再生的关系。再建立周围神经损伤模型,采用挤压损伤大鼠坐骨神经,成功建立模型后大鼠被随机分为三组,第一组:假手术组(Sham组n=16):仅暴露坐骨神经,但不进行损伤组;第二组:模型组(PNI组n=16):坐骨神经挤压损伤后生理盐水腹腔注射处理组;第三组(Lentinan组n=16):坐骨神经挤压损伤后,腹腔注射香菇多糖14天;在损伤后的第7天和第14天,各组分别处死8只大鼠。取材后的组织用免疫组化和WB(Western blot)进行评估。2、采用CCK8法,筛选出最佳药物活性浓度。在体外,在雪旺细胞系(RSC 96)中补充均质髓鞘馏12h来模拟体内神经挤压损伤后微环境,随后在含/不含香菇多糖的培养基中培养细胞。采用免疫荧光和Lyso-tracker来评估香菇多糖对雪旺细胞吞噬或清除髓鞘的能力的影响。采用mcherry-GFP-LC3质粒转染雪旺细胞分析自噬流。14天取材的组织采用WB检测神经组织中AMPK/mTOR信号通路以及自噬以及凋亡等相关标记物蛋白表达水平。在体内,在第一步的分组上添加了溶酶体抑制剂CQ处理组。即分组为:Sham组(n=8)、Sham+CQ组(n=8)、PNI 组(n=8)、PNI+CQ 组(n=8)、Lentinan 组(n=8)、Lentinan+CQ 组(n=8)。损伤后7天取材,采用WB检测神经组织中自噬标记蛋白表达水平。结果:1、香菇多糖促进坐骨神经损伤后的神经的恢复。网络药理学预测结果显示香菇多糖能促进轴突再生。根据SFI(Sciatic Function Index)测量结果显示,随着时间的推移,所有组的运动功能都有所恢复,但在第7天之后PNI组和Lentinan组开始出现差异,在治疗后2周,Lentinan组的SFI值明显优于PNI组。7天后的免疫组化和WB结果显示Lentinan组的髓鞘碎片清除明显优于PNI组。不仅如此,14天后的HE和Masson染色结果显示Lentinan组再生神经纤维明显增加,免疫组化结果也呈现相同的趋势。这些结果证明了香菇多糖促进受损周围神经的恢复2、香菇多糖通过AMPK/mTOR信号通路促进自噬通量,加速SCs清除髓鞘碎片,并抑制了神经元的凋亡,从而促进神经功能的恢复。体外实验采用的是经过CCK8筛选出合适浓度为100ug/ml,免疫荧光和Lyso-tracker结果显示香菇多糖加速了雪旺细胞清除髓鞘碎片的进程。体内实验WB和免疫荧光结果显示,Lentinan组14天后的自噬相关标记蛋白LC3升高,p62降低,而PNI组LC3和p62表达水平均升高。证明了香菇多糖明显逆转了 PNI诱导的自噬通量损伤。此外WB结果显示PNI组中的p-AMPK下降和p-mTOR表达的增加,而Lentinan组表达趋势则相反。因此,这些数据表明,香菇多糖通过激活AMPK/mTOR信号通路促进SC自噬以清除髓鞘碎片。此外,体外结果显示香菇多糖明显增加了mcherry-LC3阳性荧光点的数量。体内实验WB结果显示,在使用CQ处理后,与PNI组相比,Lentinan组的LC3I向LC3II转变的增加,p62减少。相比之下,PNI组在使用/不使用CQ时LC3和p62没有明显的差异。体内体外结果证明了急性PNI破坏了自噬通量,而香菇多糖治疗通过增强自噬体Thyroid toxicosis与溶酶体的融合促进了自噬通量。最后WB检测凋亡和自噬相关蛋白结果显示PNI组Bax/Bcl-2显著增加,www.selleck.cn/products/BAY-73-4506而Lentinan组的Bax/Bcl-2比值明显减少。p62和cleaved caspase-3免疫荧光双色标记结果显示与PNI组相比,Lentinan组p62和cleaved caspase-3表达均明显减少,证明香菇多糖治疗后可减少自噬受损的神经元凋亡。结论:香菇多糖通过AMPK/mTOR信号通路促进自噬,加速SCs清除髓鞘碎片,并抑制了神经元的凋亡,从而促进神经修复。总之我们证明了香菇多糖是治疗周围神经损伤经济有效的天然药物。