背景:破伤风毒素(Tetanus toxin,TeNT)是由破伤风杆菌产生的一种神经蛋白毒素,这种蛋白质会使感染者的抑制性突触不能释放神经递质,从而引起反射亢进和横纹肌痉挛。TeNT毒性强,估计人体致死剂量低于2.5 ng/kg,未经治疗病死率高达40%。破伤风是一种以肌肉痉挛为特征的危及生命的疾病,这种疾病是由破伤风杆菌产生的神经毒素引起的。TeNT首先是作为一个单一的150 kDa蛋白产生的,它被一个内源性蛋白酶缺刻成一个具有重链(HC,100 k Da)和轻链(LC,50 k Da)的毒素活性形式分子。重链和轻链由链间二硫键连接。重链的C端结构域负责与神经细胞结合,随后内吞形成囊泡,而重链的N端结构域主要帮助轻链穿过囊泡膜进入神经细胞中,轻链分子是一种锌依赖的蛋白酶,它通过链间的二硫键与重链连接,直到轻链到达细胞质,然后二硫键被还原并被释放到神经元的细胞质中,从而发挥毒性作用。目的:为了研究更有效的破伤风重组亚单位疫苗并探究其保护效力,本研究以TeNT为对象,通过对其各功能结构域抗原表位的免疫保护效力进行系统性研究,从而确定具有研发前景的破伤风重组亚单位疫苗的最佳功能结构域抗原分子。此外,由于TeNT的三个主要功能结构域上均含有中和表位,特Sorptive remediation别是TL-HN分子具有更强的免疫保护效力。因此,为了进一步研究更有效的候选疫苗,本研究拟制备一种具有TeNT所有中和表位的重组基因工程破伤风类毒素(m TeNT),目的是增强它的保护免疫力。方法:本研究通过基因工程技术制备了TeNT各功能结构域片段并连接到pTIG-Trx原核表达载体上,将构建的质粒转入大肠杆菌表达系统中,选择合适的条件进行诱导表达,通过AKTA纯化系统使用亲和层析法进行重组蛋白洗脱,从而获得较高纯度的重组目的蛋白。经SDS-PAGE鉴定各重组蛋白的纯度以及大小。通过Western blot鉴定各重组蛋白与抗TeNT抗体结合特异性。为了评价各重组蛋白的生物学活性,通过SDS-PAGE检测各重组蛋白对底物蛋白VAMP的切割能力;通过ELISA检测m TeNT与神经细胞相关受体GT1b、SV2B、SV2C的结合能力。检测各重组蛋白有无动物毒性,从而确保能够安全地作为亚单位疫苗分子使用。将制备的各功能结构域重组蛋白作为抗原与铝佐剂混合配制成亚单位疫苗,对小鼠进行单独抗原免疫、联合抗原免疫以及剂量依赖性免疫试验,检测免疫后的小鼠体液免疫水平、中和抗体水平和免疫保护效力。结果:功能结构域TL-HN片段在TeNT的所有功能域中具有最高的免疫保护效果。TL-HN在2次免疫后1μg组和10μg组的中和效价分别达到了10 IU/mL和80 IU/mL,它作为保护性抗原产生了最高水平的中和抗体,为所有重组抗原中所测中和效价最高,且具有明显的剂量差异。1次免疫后的小鼠攻毒10~3LD_(50)TeNT后,TL-HN,THc和TL+THN组的ED_(50)分别为42.249 ng,664.433 ng和1116.589 ng,2次免疫后的小鼠攻毒10~3LD_(50)TeNT后,TL-HN,THc和TL+THN组的ED_(50)分别为10.852 ng,31.210 ng和124.858 ng。从结果中可以看出,剂量依赖性实验再次表明功能结构域抗原TL-HN在几种重组抗原中的保护作用是最强的。在本研究中制备了TeNT的三种L-HN片段分子(TL-HN、TL-GS-HN和TL-2A-HN),均由L和HN结构域组成,不包含Hc结构域。在动物模型中探讨这些TeNT不同功能域片段的免疫学意义。TL-HN的两种变体(TL-GS-HN和TL-2A-HN)并没有提高其免疫保护作用,说明天然未修饰的重组抗原TL-HN可能具有更多的中和性抗体表位。此外,TL+THN组合抗原的保护作用弱于TL-HN抗原,说明两种功能结构域的联合没有明显的协同作用。这个结果也表明TL-HN分子的L和HN连接处或空间结构上可能保留了一些负责诱导血清中和抗体的关键表位。大量实验表明,与THc或TL和THN联合组相比,TL-HN具有更优越的保护作用。本研究通过将TeNT的轻链酶活性区的3个氨基酸(H233A,E234A和H237A)以及受体结合区的3个氨基酸(R1226L,W1289L和Y1290F)进行突变,将编码mTeNT的DNA基因序列连接到pTIG-Trx原核表达载体上。诱导表达后,经AKTA纯化系统通过亲和层析法成功获得了目的蛋白。Western blot实验表明m TeNT与破伤风毒素的两个主要功能结构域(酶活性区和受体结合区)免疫血清抗体均具有良好的结合特异性。与破伤风毒素相比,重组蛋白m TeNT既不能够切割底物VAMP2,也不与神经节甘脂GT1b结合,这些结果表明该重组破伤风类毒素(m TeNT)设计符合预期,无酶活性区和受体结合能力。以20μg剂量的m TeNT经腹腔注射KM小鼠后,连续观察一周,小鼠仍全部存活,毒力检测实验表明重组蛋白m TeNT毒力至少降低40万倍,表明本研究制备的m TeNT无毒性,后续能够开展动物免疫保护效力评价研究。保护性实验及剂量依赖性实验表明,重组抗原m TeNT具有良好的免疫保护效力,重组抗原m TeNT ED_(50)效力值远低于甲醛灭活的TT疫苗组,表明这种无化学试剂修饰的全长毒素分子蛋白Ipatasertib临床试验具有更好的构象和中和表位,其免疫保护效力更高;重组抗原m TeNT也比联合组抗原TL-HN+THc的ED_(50)效力略优,进一步体现了全长毒素分子的免疫效力,同时也说明THN和THc的连接处可能无重要的抗原中和表位。总之,重组抗原m TeNT包含了TeNT所有的抗原中和表位。结论:本研究结果首次揭示了TeNT中L-HN功能片段的强保护作用。TL-HN功能结构域分子的结构构象正确、具有酶活性,因此可作为一种筛选抗TeNT抗体分子的抗原免疫分子,也为研究TeNaporafenib NMRNT的活性和构象提供了新的功能分子。因此,TL-HN片段应该在破伤风毒素的免疫保护中发挥着重要作用,为破伤风毒素疫苗或抗体的开发提供了新的研究方向,并可能取代THc或TT作为破伤风毒素候选亚单位疫苗。本研究结果进一步表明,通过基因工程技术灭活的mTeNT疫苗相较于甲醛灭活的TT具有生产方便、批间差异小、免疫保护效力好的优点。因此,基因工程技术灭活的mTeNT疫苗可作为预防破伤风中毒的候选疫苗品种。